人雪旺細胞促進人臍帶間充質(zhì)干細胞向神經(jīng)方向分化的研究.pdf

1、[目的]：
　　觀察人雪旺細胞(human Schwann cells，hSCs)對人臍帶間充質(zhì)干細胞(human umbilical cord-mesenchymal stem cells，hUC-MSCs)在脊髓損傷(spinalcord injury，SCI)大鼠體內(nèi)存活、分化的影響；描述膠質(zhì)纖維酸性蛋白(glialfibrillary acidic protein，GFAP)、髓磷脂堿性蛋白(myelin basic pr

2、otein，MBP)與高分子量神經(jīng)絲蛋白(high molecular weight neurofilament，NF-H)表達的時間特征，并探討hSCs促進hUC-MSCs向神經(jīng)方向分化的可能機制。
　　[方法]：
　　無菌條件下取出健康、因外傷行截肢治療患者的坐骨神經(jīng)，應用雙酶消化組織塊結(jié)合機械分離法分離培養(yǎng)hSCs、采用低濃度胰蛋白酶消化和差速貼壁法對細胞進行純化，傳至第4代(P4)的hSCs用S-100抗體對其進行鑒

3、定，本實驗植入的hSCs為P5；實驗所用的hUC-MSCs由天津協(xié)和干細胞基因工程有限公司提供，細胞經(jīng)過流式細胞儀鑒定符合干細胞標準，植入的hUC-MSCs亦為P5。馭8周齡雌性Wistar大鼠80只，以Impactor Model-Ⅱ型打擊器制作脊髓胸10(T10)損傷模型。實驗隨機均分為4組：DMEM對照組(A)，hSCs移植組(B)，hUC-MSCs移植組(C)，hUC-MSCs與hSCs聯(lián)合移植組(D)。移植后2w，4w，各組實

4、驗動物隨機取出2只經(jīng)心臟灌注后取材固定(脊髓長度包括損傷中心頭尾端長約1.5cm)，制成石蠟切片后行GFAP，MBP與NF-H免疫熒光染色，植入的細胞行MAB1281免疫熒光染色進行體內(nèi)示蹤。各組分別于移植后1w，2w，3w，4w以同樣方法取材，分別行Western-Blot，Real-Time PCR檢測。上述數(shù)據(jù)用SPSS16.0軟件方差分析進行統(tǒng)計分析。
　　[結(jié)果]：
　　hSCs在原代培養(yǎng)第3天即可從組織塊邊緣爬出

5、，至第9天時即可觀察到有大量的細胞長出，2w后進行細胞傳代，該細胞可以在體外穩(wěn)定傳至5代以上；P5代的hUC-MSCs在鏡下觀察可見其形態(tài)規(guī)則、大小均一、呈漩渦狀生長。
　　免疫熒光染色顯示：A組未見到MAB1281陽性染色細胞，而其它各組為陽性染色；D組可觀察到MBP與NF-H陽性染色細胞，其它各組為陰性染色。
　　Western-Blot，Real-Time PCR檢測結(jié)果顯示：A組3種神經(jīng)標志物在蛋白與mRNA水平的表

6、達量隨時間延長均逐漸增高，且GFAP的表達量在移植后第2w明顯增高(Western-blot所測第2w與第1w的GFAP條帶灰度值比值為1.34而PCR所測mRNA比值為2.86±0.33)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；而MBP與NF-H的表達量在移植后第3w明顯增高(Western-blot所測第3w與第1w的MBP條帶灰度值比值為3.43而PCR所測mRNA比值為6.47±0.62，NF-H所測結(jié)果的比值則分別為4.12，6.

7、78±0.77)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。與A組相對應時間點比較，細胞移植組MBP，NF-H的表達量較高而GFAP的表達量較低，其中D組的MBP，NF-H的表達量最高(D組與A組MBP在第3w時條帶灰度值比值為2.11而NF-H在第3w時條帶灰度值比值為2.11)，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)；雖然D組GFAP的表達在第2w較第1w增高，但其在第2，3與4w時間點之間的表達量差異(各周所測條帶灰度比值依次為1:1.12:1