模擬肝臟組織微環(huán)境對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化的影響.pdf

1、目的:體外條件下，采用組織塊培養(yǎng)法分離培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞(humanumbilicalcordmesenchymalstemcells，hUCMSCs)。利用大鼠肝組織勻漿上清液(livertissuehomogenatesupematant，LHS)模擬肝臟組織微環(huán)境對人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，從細(xì)胞形態(tài)、肝細(xì)胞標(biāo)志物甲胎蛋白（alphafetoprotein，AFP）、細(xì)胞角蛋白18（cytokeratin-18，CK-1

2、8）以及肝臟功能蛋白色氨酸2，3-加雙氧酶(tryptophan2，3-dioxygenase，TPH2)表達(dá)等方面考察人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞在肝臟組織微環(huán)境中向肝細(xì)胞定向分化的能力，以期為臨床應(yīng)用干細(xì)胞治療終末期肝病提供理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 1hUCMSCs的分離培養(yǎng)、表型及分化潛能鑒定
　　 無菌條件下收集足月產(chǎn)胎兒的臍帶并儲(chǔ)存于0.9％的無菌生理鹽水中。在超凈工作臺(tái)內(nèi)用PBS洗去臍帶中殘余血

3、液并剪為3-4cm的小段。沿縱軸剖開臍帶，暴露并剔除臍動(dòng)脈和臍靜脈，分離臍帶基質(zhì)即華爾通膠(wharton'sjelly)，將其剪為0.5-1.0mm3的組織塊。采用組織塊培養(yǎng)法，加入含10％胎牛血清、100U/mL青霉素、100μg/mL鏈霉素的DMEM/F12培養(yǎng)基10mL;置于37℃、飽和濕度、體積分?jǐn)?shù)為5％的CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。待細(xì)胞長至80-90％匯合后吸棄組織塊，細(xì)胞進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取處于對數(shù)生長期的第3代貼壁細(xì)胞制成單細(xì)胞

4、懸液，采用流式細(xì)胞術(shù)檢測hUCMSCs的間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymalstemcells，MSCs)標(biāo)志物的表達(dá)。取處于對數(shù)生長期的第3代貼壁細(xì)胞，消化收集，離心重懸，以2×104個(gè)/孔的密度接種于24孔板;分別采用成骨、成脂誘導(dǎo)培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)，14天后分別采用VonKossa染色法檢測鈣化基質(zhì)沉淀和油紅O染色法檢測脂滴。
　　 2LHS誘導(dǎo)hUCMSCs向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化
　　 Sprague-Dawley(SD

5、)大鼠，2％戊巴比妥鈉按3mL/kg腹腔注射麻醉，固定四肢，消毒皮膚。打開腹腔，分離下腔靜脈和肝門靜脈，結(jié)扎肝門靜脈遠(yuǎn)端。從肝門靜脈近端進(jìn)針并固定，用4℃預(yù)冷的生理鹽水自肝門靜脈進(jìn)行肝臟灌流，待肝臟體積增大、肝葉變白時(shí)開放下腔靜脈以利于灌流液排出，共灌流約30min。灌流結(jié)束后取出肝組織置于冰上，剔除被膜及韌帶。稱取濕重，按150mg/mL加入DMEM/F12培養(yǎng)基;冰浴條件下進(jìn)行肝組織勻漿。4℃，150009離心30min，取上清液，

6、0.22μm濾器過濾除菌，分裝，-70℃冰箱儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?br>　　 取處于對數(shù)生長期的第3代貼壁細(xì)胞，以1×105個(gè)/皿的細(xì)胞密度接種于直徑為35mm塑料培養(yǎng)皿中，待細(xì)胞長至約80％匯合，吸棄培養(yǎng)基，加入誘導(dǎo)培養(yǎng)基（肝組織勻漿上清液）進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)分組為6組:陰性對照組、陽性對照組、標(biāo)準(zhǔn)對照組，LHS誘導(dǎo)hUCMSCs3天，5天，7天組;選取單純LHS作為陰性對照組，QSG-7701人肝細(xì)胞株作為陽性對照組，常規(guī)培養(yǎng)的hUCMSC

7、s作為標(biāo)準(zhǔn)對照組。倒置顯微鏡下觀察并記錄各組細(xì)胞形態(tài)。提取上述各組細(xì)胞總RNA，采用RT-PCR方法檢測肝細(xì)胞標(biāo)志物甲胎蛋白(alphafetoprotein，AFP)、細(xì)胞角蛋白18(cytokeratin-18，CK-18)及肝臟功能蛋白色氨酸2，3-加雙氧酶(tryptophan2，3-dioxygenase，TPH2)的mRNA表達(dá)情況。
　　 取處于對數(shù)生長期的第3代貼壁細(xì)胞，以5×105個(gè)/瓶的細(xì)胞密度接種于25cm

8、2塑料培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組同上。提取上述各組細(xì)胞總蛋白，BCA法測定各組樣品的蛋白濃度。采用Westenblot方法檢測肝細(xì)胞標(biāo)志物AFP、CK-18及肝臟功能蛋白TPH2的表達(dá)情況。
　　 3數(shù)據(jù)處理與統(tǒng)計(jì)分析
　　 上述實(shí)驗(yàn)均重復(fù)三次，統(tǒng)計(jì)結(jié)果以mean±SD表示;應(yīng)用SPSS13.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用單因素方差分析（One-WayANOVA）繼以Dunnettttest對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。統(tǒng)計(jì)結(jié)果以P＜0.05

9、視為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果:
　　 1hUCMSCs的分離培養(yǎng)、表型及分化潛能鑒定
　　 倒置顯微鏡下觀察，人臍帶基質(zhì)采用組織塊培養(yǎng)法培養(yǎng)10-14天，可見組織塊邊緣有長梭形的成纖維樣細(xì)胞長出;繼續(xù)培養(yǎng)7-10天細(xì)胞長至80％-90％匯合，呈漩渦狀或放射狀排列。
　　 流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示:hUCMSCs高表達(dá)CD29、CD44、CD105、CD73、CD90等MSCs表面標(biāo)志分子，不表達(dá)造血

10、細(xì)胞標(biāo)志物CD34、CD45及內(nèi)皮細(xì)胞特征性表面標(biāo)志分子CD31;也不表達(dá)人類白細(xì)胞抗原HLA-DR。表明hUCMSCs的免疫表型符合MSCs的免疫表型特征。
　　 分化潛能鑒定結(jié)果顯示:hUCMSCs經(jīng)成骨誘導(dǎo)后，細(xì)胞逐漸由長梭形轉(zhuǎn)變?yōu)椴灰?guī)則形細(xì)胞，經(jīng)VonKossa染色可見黑色鈣基質(zhì)沉淀。hUCMSCs經(jīng)成脂誘導(dǎo)后，細(xì)胞逐漸由長梭形轉(zhuǎn)變?yōu)榉蚀蟮膱A梭形細(xì)胞，胞漿內(nèi)可見透亮脂滴，油紅O染色可見大量紅色透亮脂滴。表明hUCMSCs

11、具有向骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化的潛能。
　　 2LHS誘導(dǎo)hUCMSCs向肝細(xì)胞樣細(xì)胞分化
　　 倒置顯微鏡下觀察，hUCMSCs經(jīng)LHS誘導(dǎo)培養(yǎng)3天后，梭形細(xì)胞開始減少，細(xì)胞兩極回縮，胞體變短;誘導(dǎo)培養(yǎng)5天后，梭形細(xì)胞繼續(xù)減少，部分細(xì)胞呈三角形或多角形;誘導(dǎo)培養(yǎng)7天后，大多數(shù)細(xì)胞呈不規(guī)則形或類圓形，核大而圓，類似肝細(xì)胞形態(tài)。
　　 肝細(xì)胞標(biāo)志物AFP、CK-18檢測結(jié)果顯示:與標(biāo)準(zhǔn)對照組相比，LHS誘導(dǎo)3天、5天、

12、7天組AFP、CK-18在mRNA(RT-PCR)和蛋白質(zhì)(Westernblot)水平表達(dá)均顯著增強(qiáng)(P＜0.01)。其中，AFP的表達(dá)量在誘導(dǎo)5天時(shí)達(dá)到峰值，隨后下降;CK-18的表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間延長而增加。
　　 肝臟功能蛋白TPH2檢測結(jié)果顯示:與標(biāo)準(zhǔn)對照組相比，LHS誘導(dǎo)3天、5天、7天組TPH2在mRNA(RT-PCR)和蛋白質(zhì)(Westernblot)水平表達(dá)均顯著增強(qiáng)(P＜0.01)，其表達(dá)量隨誘導(dǎo)時(shí)間延長而增加