體外研究人臍帶血間充質干細胞誘導大鼠枯否細胞M2極化.pdf

1、目的：眾所周知，目前晚期肝硬化患者除肝移植外無較好的治療方法，但肝移植供體緊缺，配型復雜，等待周期長，移植費用高，極大的限制了肝移植的臨床應用。隨著干細胞替代治療研究的興起，目前干細胞移植有望成為終末期肝病的有效治療方法。間充質干細胞(mesenchymal stem cell,MSCs)具有強大的分化能力能為許多終末期疾病帶來希望，是一種多能干細胞。具有提取方法簡單，低成本，低免疫性等特點。隨著研究的深入，越來越多的證據表明MSCs通

2、過免疫調節(jié)或者分泌細胞因子的機制來調節(jié)炎癥反應和組織修復，從而發(fā)揮其主要的治療作用。本實驗采用內毒素(lipopolysaccharide，LPS)誘導大鼠枯否細胞(kupffer cells,KCs)發(fā)生極化改變，之后用人臍帶血間充質干細胞(human umbilical cord blood mesenchymal stem cells，huMSCs)與LPS誘導的KCs在transwell內共培養(yǎng)，觀察huMSCs對KCs極化偏移

3、的調節(jié)作用，進一步來研究MSCs對炎癥免疫調節(jié)及其作用機制。
　　方法：采用膠原酶在體灌注和離體消化、密度梯度離心和選擇性貼壁法，并結合機械分離和振蕩孵育，最大程度的消化SD大鼠肝組織從而高效得到更多的原代KCs。經過形態(tài)觀察，吞噬功能檢測，細胞表面標志檢測等方法驗證細胞。成功取得KCs后，進行培養(yǎng)。同時進行huMSCs細胞培養(yǎng)，觀察，驗證。之后將KCs與MSCs在Transwell內共培養(yǎng)。實驗分為KCs組(正常組)，KCs細胞

4、+LPS組(對照組)，MSCs+KC+LPS組(實驗組)。實驗組用經典的LPS刺激原代大鼠KCs發(fā)生極化后再與huMSCs共培養(yǎng)18h，正常組加入等量DMEM培養(yǎng)基，對照組在LPS刺激后，加入DMEM培養(yǎng)基作為對照。觀察同一時間點各組的IL-4，腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor-α,TNF-α)，IL-10，IL-6等上清因子變化，以上上清因子用ELISA法進行檢測；用Westing-blot方法檢測誘導型一氧化

5、氮合酶(inducible nitricoxide synthase，iNOS)，精氨酸酶-1(arginase-1,Arg-1)，信號傳導與轉錄激活因子(signal transducer and activator of transcription,STAT)STAT-3，STAT-6，核因子kappaB(nuclear factor-kB，NF-κB)。同時用qRT-PCR對以上結果進行驗證。檢測結果采用統(tǒng)計學軟件分析，均數±標準

6、差(X±S)表示，F(xiàn)檢驗判斷兩樣本間的方差齊性，多組間差異檢驗采用單因素方差分析，t檢驗分析兩組間統(tǒng)計學差異。
　　結果：對照組促炎因子TNF-α分泌增加，實驗組抑炎因子IL-10，IL-4分泌增加，而IL-6的分泌實驗組升高更明顯；而Western-blot檢測表明對照組中iNOS升高，NF-κBp65入核增高，而實驗組高表達Arg-1，同時pSTAT-3，pSTAT-6表達增加，NF-κBp65入核減少，但是NF-κBpp65

7、核內增多。經統(tǒng)計學檢測結果提示huMSCs與枯否細胞極化后共培養(yǎng)后與對照組及空白組存在明顯差異。
　　結論：分析以上數據結果表明huMSCs能誘導KCs向M2表型偏移，主要表現(xiàn)為抗炎因子分泌增加，Arg-1合成增加，考慮可能與huMSCs分泌細胞因子有關，起到一種免疫調節(jié)作用，huMSCs調節(jié)巨噬細胞極化的分子機制可能與通過JAK-STAT信號轉導通路有關。該結論首次用不同種屬細胞共培養(yǎng)研究巨噬細胞極化問題，且采用原代大鼠枯否細胞