人胎兒肝干細(xì)胞-聚酸酐復(fù)合載體體外共培養(yǎng)的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的： 從人胎兒肝臟中分離、純化、培養(yǎng)原代胎兒肝干細(xì)胞，對(duì)其表面標(biāo)志物進(jìn)行鑒定，并傳代培養(yǎng)，探討人胎兒肝干細(xì)胞和聚酸酐復(fù)合載體支架體外共同培養(yǎng)，觀察胎兒肝干細(xì)胞在載體上生長(zhǎng)狀態(tài)，評(píng)價(jià)聚酸酐復(fù)合載體支架對(duì)胎兒肝干細(xì)胞的影響。 方法： 采用改進(jìn)的兩步膠原酶灌注消化法加percoll液不連續(xù)密度梯度離心的方法分離胎兒肝干細(xì)胞。計(jì)數(shù)并臺(tái)盼藍(lán)拒染測(cè)定細(xì)胞活性率，調(diào)整細(xì)胞密度接種培養(yǎng)在DMEM/F12培養(yǎng)基中，觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情

2、況。光鏡觀察從形態(tài)上鑒定分離的細(xì)胞，采用免疫熒光化學(xué)染色法對(duì)分離的胎肝細(xì)胞進(jìn)行鑒定，并利用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞表面標(biāo)志物。首先篩選經(jīng)過(guò)不同方式加工修飾的聚酸酐復(fù)合載體，應(yīng)用傳代培養(yǎng)第3代的人胎兒肝干細(xì)胞，在鋪蓋聚酸酐復(fù)合載體支架的培養(yǎng)液中進(jìn)行長(zhǎng)時(shí)間培養(yǎng)。設(shè)立相同培養(yǎng)液的平板對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組為復(fù)合載體上培養(yǎng)。實(shí)驗(yàn)組分6組，A1組：多孔未修飾組；A2組：多孔多糖修飾組；A3組：多孔多肽修飾組：B1組：電紡絲未修飾組；B2組：電紡絲多糖修飾組；B

3、3組：電紡絲多肽修飾組。倒置顯微鏡下觀察各組細(xì)胞生長(zhǎng)狀況；計(jì)算細(xì)胞貼壁率；MTT法檢測(cè)各組細(xì)胞的吸光度值(OD值)；收集各組載體支架上細(xì)胞并計(jì)數(shù)。經(jīng)過(guò)篩選后得到較好的聚酸酐復(fù)合載體，取細(xì)胞載體進(jìn)行組織學(xué)切片，HE染色光鏡下觀察。在細(xì)胞培養(yǎng)第7天進(jìn)行免疫熒光化學(xué)染色和流式細(xì)胞儀檢測(cè)。應(yīng)用Spass12.0forwindows進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)，多組比較采用單因素方差分析。 結(jié)果： 兩步膠原酶灌注消化胎兒肝臟結(jié)締組織得到胎兒肝干細(xì)

4、胞，經(jīng)多次臺(tái)盼蘭(trypanblue)拒染實(shí)驗(yàn)檢測(cè)，細(xì)胞活性率為(91.20±1.75)％。光鏡下觀察游離的單個(gè)肝干細(xì)胞，呈卵圓形，其大小約為正常肝細(xì)胞的1/6～1/3，細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果顯示：新鮮分離純化的胎兒肝干細(xì)胞AFP、CK19、Vim、ALB陽(yáng)性表達(dá)率為(60.8±3.6)％、(61.5±4.7)％、(57.4±5.1)％、(43.3±2.7)％，CD34、CD49f、CD133、CD105陽(yáng)性表達(dá)率

5、為0.9％～3.4％、2.8％～4.4％、0.8％～1.6％、61.1％～68.5％。肝臟細(xì)胞平均產(chǎn)量為(8.39±0.58)×109個(gè)/肝(n=8)，肝干細(xì)胞產(chǎn)量為(1.79±0.54)×107個(gè)/肝(n=8)或?yàn)?4.54±2.42)×105個(gè)/g。MTT法測(cè)定450nm吸光度值(OD值)，各實(shí)驗(yàn)組在第1天到第9天取樣的吸光度均值逐漸增高，與對(duì)照組細(xì)胞增殖活力無(wú)明顯差別；經(jīng)過(guò)篩選A2組多糖修飾的多孔聚酸酐復(fù)合載體較好，細(xì)胞在培養(yǎng)的最

6、初6小時(shí)內(nèi)易于貼附，培養(yǎng)第9天A2組在各實(shí)驗(yàn)組中收獲細(xì)胞數(shù)量最多，為(93.667±1.438)×104；倒置顯微鏡下觀察A2組復(fù)合載體支架上的細(xì)胞形態(tài)良好，細(xì)胞貼附生長(zhǎng)，可以連續(xù)培養(yǎng)；培養(yǎng)第7天A2組細(xì)胞免疫熒光化學(xué)染色AFP、CK19、Vim、ALB陽(yáng)性表達(dá)率分別為(59.3±3.5)％、(62.2±3.7)％、(56.8±2.7)％、(48.4±4.0)％，流式細(xì)胞儀檢測(cè)CD34、CD49f、CD133、CD105陽(yáng)性表達(dá)率為0.

7、5％～3.3％、0.9％～3.5％、0.4％～2.1％、59.1％～66.3％。 結(jié)論： 兩步膠原酶灌注和不連續(xù)percoll密度梯度離心法得到肝干細(xì)胞活性和數(shù)量均可，胎兒肝干細(xì)胞傳代后可生長(zhǎng)，人胎兒肝干細(xì)胞與復(fù)合載體經(jīng)過(guò)連續(xù)40天共同培養(yǎng)，聚酸酐復(fù)合載體對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯毒性，人胎兒肝干細(xì)胞可以很好的貼附于聚酸酐復(fù)合載體支架上，細(xì)胞增殖活力良好，表面標(biāo)志物繼續(xù)表達(dá)，多糖修飾的多孔聚酸酐復(fù)合載體培養(yǎng)9天得到的細(xì)胞數(shù)量增多19.