小鼠眼部堿燒傷后骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞歸巢到角膜組織的檢測(cè)及影響因素分析.pdf

1、摘要第一章小鼠堿燒傷完全性角膜緣干細(xì)胞功能失代償模型的建立及評(píng)價(jià)目的建立模擬臨床的小鼠堿燒傷完全性角膜緣干細(xì)胞功能失代償模型，為研究堿燒傷引發(fā)的完全性角膜緣干細(xì)胞功能失代償提供簡(jiǎn)單、穩(wěn)定的動(dòng)物模型。方法選取6—8周齡C57小鼠30只，全身麻醉后將浸有05mol／L氫氧化鈉溶液的環(huán)形濾紙片(內(nèi)徑3mm，外徑5ram)置于角膜緣30秒后取下，然后應(yīng)用生理鹽水沖洗結(jié)膜囊30秒；術(shù)后1天、3天、5天、7天、10天、14天、21天及30天，應(yīng)用裂

2、隙燈顯微鏡觀察角膜上皮完整性、基質(zhì)透明性及新生血管化情況；每個(gè)時(shí)間點(diǎn)隨機(jī)抽取3只小鼠取材，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查；術(shù)后21天進(jìn)行角膜免疫印跡細(xì)胞學(xué)檢查。結(jié)果①裂隙燈檢查：術(shù)后1天：角膜緣缺血，可見邊界清楚的灰白色環(huán)狀混濁區(qū)，大小與濾紙片直徑一致，全角膜水腫、上皮缺損；術(shù)后3—5天：角膜灰白色混濁，水腫加重；術(shù)后710天：角膜水腫逐漸減輕，上皮恢復(fù)完整；術(shù)后14天：角膜緣可見毛刷狀新生血管生長(zhǎng)；術(shù)后21天：角膜緣較多新生血管長(zhǎng)入角膜基質(zhì)；術(shù)后

3、30天：角膜混濁、新生血管化，部分模型發(fā)生瞼球粘連；②HE染色：術(shù)后卜5天：角膜上皮層、基質(zhì)層內(nèi)可見大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，角膜基質(zhì)水腫、明顯增厚、膠原纖維排列不規(guī)則、較疏松；術(shù)后710天：角膜表面單層上皮覆蓋，基質(zhì)水腫逐漸減輕，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)減少；術(shù)后14天：角膜表面覆蓋2—3層上皮細(xì)胞，基質(zhì)無明顯水腫，膠原纖維排列相對(duì)整齊；術(shù)后21天：角膜基質(zhì)內(nèi)較多新生血管增生，管腔內(nèi)有成熟紅細(xì)胞；術(shù)后30天：角膜上皮層內(nèi)可見較多杯狀細(xì)胞；③免疫印跡細(xì)胞學(xué)

4、檢查：角膜表面可見較多核大、核質(zhì)比例約1／2、嗜伊紅染色的杯狀細(xì)胞，PAS染色陽(yáng)性，為結(jié)膜細(xì)胞表型。結(jié)論①應(yīng)用環(huán)形濾紙片堿燒傷的方法制作小鼠完全性角膜緣干細(xì)胞功能失代償模型，角膜表面可見較多杯狀細(xì)胞，裂隙燈檢查見小鼠角膜的體征符合臨床上“完全性角膜緣干細(xì)胞功能失代償”的診斷標(biāo)準(zhǔn)。②此方法操作簡(jiǎn)單，易于重復(fù)，為下一步的在體研究提供了良好的動(dòng)物模型。第三章眼表炎癥因子及高滲透壓環(huán)境對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響目的檢測(cè)眼表主要炎癥因

5、子(白介素一1B)及高滲透壓環(huán)境(4060sm)對(duì)小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)、活細(xì)胞率、增殖及遷移能力等生物學(xué)性狀的影響。方法體外分離小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)，設(shè)置正常對(duì)照組、5ng／ml工L一1B組、10ng／mlIL一1B組、20ng／mlIL一1B組及高滲組，分別應(yīng)用MTT法、細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)、劃痕法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果①細(xì)胞形態(tài)：原代培養(yǎng)的細(xì)胞呈梭形，排列具有方向性，胞漿豐富，細(xì)胞核較大，呈圓形，位于細(xì)胞中央；5ng／mlIL一1B

6、組細(xì)胞形態(tài)無明顯差異；隨著培養(yǎng)基中IL一10濃度升高，出現(xiàn)較多漂浮細(xì)胞，細(xì)胞變小，多呈圓形；高滲組培養(yǎng)基中出現(xiàn)大量漂浮細(xì)胞，貼壁細(xì)胞排列松散，形態(tài)不規(guī)則，失去梭形外觀，細(xì)胞膜皺縮，反光增強(qiáng)。②MTT法：正常對(duì)照組吸光度(0D值)為04980043(m5)；5ng／mlIL一10組0D值為04990038(JrF5)，與正常對(duì)照組相比，t=0035，P=0974，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；10ng／mlIL一1B組、20ng／mlIL一1B組及高

7、滲組oD值明顯減少，以高滲組為著，與正常對(duì)照組相比，tr=6209，阼0003，鏟8881，繆O001，t，=10146，Py0001，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；③細(xì)胞克隆形成試驗(yàn)：正常對(duì)照組細(xì)胞能形成較多克隆，克隆形成率為18200192396(JrF3)；5ng／mlIL一1p組克隆形成率下降至17400i207496(n=3)，與正常對(duì)照組相比，t=0667，P=0541，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；10ng／mlIL一1B組、20ng／mlI

8、L一1B組及高滲組克隆形成率進(jìn)一步減少，以高滲組為著，與正常對(duì)照組相比，tr=12348，只=0000，tyl7250，繆0000，鏟11943，序0000，差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；④劃痕法：正常對(duì)照組細(xì)胞遷移能力旺盛，72小時(shí)全部越過劃痕；5ng／mlIL1B組細(xì)胞遷移能力未受明顯影響，72小時(shí)全部越過劃痕；10ng／mlIL一1B組、20ng／mlIL—lB組及高滲組24小時(shí)、48小時(shí)及72小時(shí)細(xì)胞遷移能力均明顯下降，以高滲組為著，與