超聲微泡預(yù)處理對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向缺血心肌歸巢的影響及機(jī)制研究.pdf

1、第一部分骨髓干細(xì)胞移植治療急性心肌梗死遠(yuǎn)期效應(yīng)的薈萃分析
　　目的：通過對隨訪期達(dá)2年或以上的隨機(jī)臨床試驗進(jìn)行薈萃分析，探討骨髓源性干細(xì)胞(bone marrow-derived stem cells,BMDSCs)移植治療急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)的遠(yuǎn)期效應(yīng)。
　　方法：對MEDLINE、EMBASE、Cochrane圖書館和Cochrane中心臨床對照試驗、中國生物醫(yī)學(xué)

2、磁盤數(shù)據(jù)庫進(jìn)行系統(tǒng)檢索（截止至2012年7月）。按照標(biāo)準(zhǔn)流程提取資料，用隨機(jī)效應(yīng)模型分析資料（僅主要不良事件用固定效應(yīng)模型）。
　　結(jié)果：共入選了6個臨床試驗計551個患者。與對照組相比，BMDSCs移植使左心室射血分?jǐn)?shù)(left ventricular ejection fraction，LVEF)顯著增加(5.09％，95％ CI:2.67％ to 7.52％，P＜0.0001)，左心室收縮末期容積顯著減小(-6.93ml，9

3、5％ CI:-13.28 to -0.58，P=0.03)，左心室舒張末期容積有減少趨勢(-6.12ml，95％ CI:-15.01 to 2.77，P=0.18)。亞組分析顯示，基線LVEF低于42％的患者從BMDSCs治療中獲益明顯，LVEF顯著改善，而基線LVEF高于42％的患者未能從中獲益。BMDSCs移植后遠(yuǎn)期主要臨床不良事件有減少趨勢，但多數(shù)沒有顯著性差異。
　　結(jié)論：BMDSCs移植治療AMI是安全有效的，可以在標(biāo)準(zhǔn)

4、治療的基礎(chǔ)上進(jìn)一步改善左心室收縮功能，并且這種獲益可以持續(xù)至少2年以上。該效應(yīng)需要在未來的研究中進(jìn)一步證實。
　　第二部分超聲微泡預(yù)處理對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞向缺血心肌歸巢的影響
　　目的：探討超聲微泡(ultrasound-exposed microbubbles，UM)預(yù)處理對骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)向缺血心肌歸巢及梗死后心功能的影響。
　　方

5、法：
　　1、采用密度梯度離心法分離大鼠BMSCs，流式細(xì)胞術(shù)鑒定細(xì)胞表面分子標(biāo)記。CCK-8法測定不同條件UM輻照對BMSCs活性的影響。用CD-Mil標(biāo)記BMSCs。
　　2、將AMI大鼠模型分為PBS組、干細(xì)胞治療(SCT)組、超聲+干細(xì)胞治療(USCT)組及UM+干細(xì)胞治療(UMSCT)組，分別在制備AMI模型后經(jīng)尾靜脈注入PBS、干細(xì)胞、US預(yù)處理后的干細(xì)胞(USCT)和UM預(yù)處理后的干細(xì)胞(UMSCT)。干預(yù)后4

6、8h和1周分別用共聚焦顯微鏡檢測BMSCs向缺血心肌的歸巢情況;4周后超聲心動圖檢測心功能，HE和Masson染色觀察缺血心肌局部的組織結(jié)構(gòu)，免疫組化檢測局部微小動脈(α-SMA)和薪生毛細(xì)血管密度(CD31)等。
　　結(jié)果：
　　1、流式細(xì)胞檢測結(jié)果顯示細(xì)胞表面高表達(dá)CD44(99.34％)及CD29(99.35％)，幾乎不表達(dá)CD34(1.47％)及CD45(1.56％)。CCK-8法檢測顯示在微泡終濃度為106/ml，

7、超聲頻率為1MHz，強(qiáng)度為1W/cm2，輻照時間為30s的條件下，UM對BMSCs的活性沒有顯著影響;超過此范圍，則會對BMSCs的活性產(chǎn)生影響。熒光顯微鏡觀察顯示絕大部分BMSCs均可被CM-Dil標(biāo)記，細(xì)胞膜呈均勻明亮的紅色，CM-Dil標(biāo)記的陽性率約為97％。
　　2、共聚焦顯微鏡觀察并計數(shù)各組在BMSCs移植48h后心肌缺血區(qū)CM-Dil陽性的細(xì)胞數(shù)，結(jié)果顯示:USCT組熒光陽性細(xì)胞數(shù)(19.67±2.08)與SCT組熒光

8、陽性細(xì)胞數(shù)(18.67±2.08)無統(tǒng)計學(xué)差異;而UMSCT組熒光陽性細(xì)胞數(shù)(39.33±3.06)多于USCT組和SCT組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)。
　　BMSCs移植1周后的共聚焦檢查結(jié)果仍有相似的趨勢。BMSCs移植4周后心臟超聲結(jié)果顯示:USCT組的左心室收縮功能(EF為44.92±2.77％，F(xiàn)S為22.83±1.79％)與SCT組(EF為42.28±2.82％，F(xiàn)S為21.52±1.88％)無明顯差異（P＞0

9、.05），但顯著強(qiáng)于PBS組(EF為20.52±1.88％，F(xiàn)S為9.55±0.85％)(P＜0.05)。UMSCT組的左心室收縮功能(EF為61.85±3.15％，F(xiàn)S為32.74±2.45％)顯著強(qiáng)于USCT組和SCT組（P＜0.05），但仍低于假手術(shù)組(EF為75.88±4.52％，F(xiàn)S為42.76±2.88％)(P＜0.05)。取移植4周后的心臟標(biāo)本行病理學(xué)檢查，Masson染色顯示USCT組的梗死面積百分比（35.9±1.1％

10、）與SCT組（36.5±1.3％）無明顯差異（P＞0.05），但顯著小于PBS組（45.2±1.4％）(P＜0.05)。UMSCT組的梗死面積百分比（25.8±1.0％）顯著小于USCT組和SCT組(P＜0.05）。免疫組化結(jié)果顯示USCT組的微小動脈密度（13.6±0.9）和新生毛細(xì)血密度（25.9±1.3）與SCT組(微小動脈密度13.2±0.8，新生毛細(xì)血密度25.2±1.3)無明顯差異(P＞0.05)，但顯著多于PBS組（微小動

11、脈密度7.8±0.5，新生毛細(xì)血密度17.6±1.1）（P＜0.05）。UMSCT組的微小動脈密度(19.5±1.1)和新生毛細(xì)血密度(33.2±1.6)顯著多于USCT組和SCT組（P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、UM預(yù)處理在一定的條件下對BMSCs的活性沒有影響。CM-Dil可以在體外有效標(biāo)記BMSCs，并能有效示蹤BMSCs在體內(nèi)的分布，但有時效性。
　　2、UM預(yù)處理可促進(jìn)經(jīng)靜脈移植的BMSCs向心肌缺血

12、區(qū)的歸巢，進(jìn)一步促進(jìn)微小動脈和毛細(xì)血管的新生，減少梗死面積，改善AMI后心功能。
　　第三部分超聲微泡預(yù)處理促進(jìn)BMSCs歸巢的機(jī)制研究——CXCR4的作用
　　目的：探討CXCR4在UM預(yù)處理促進(jìn)BMSCs靶向歸巢中的作用及可能機(jī)制。
　　方法：
　　1、取第3代BMSCs分為4組進(jìn)行干預(yù):對照組、超聲(US)組、超聲微泡(UM)組和超聲微泡+過氧化氫酶(UMC)組，RT-PCR和Western Blot測定各

13、組CXCR4mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平。
　　2、將第3代BMSCs用Fluo-4/AM孵育標(biāo)記后分為3組進(jìn)行干預(yù):對照組、US組和UM組，分別在干預(yù)后即刻、5min、15min在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度，比較分析細(xì)胞內(nèi)鈣離子水平。
　　3、將第3代BMSCs分為6組:對照組、US組、UM組、UMC組、超聲微泡+AMD3100(UMA)組和超聲微泡+抗CXCR4抗體(UMCX)組，遷移試驗觀察各組BMSCs向基質(zhì)衍生因

14、子-1α(stromal derived factor 1α，SDF-1α)的趨化能力。
　　4、將BMSCs分為7組，A組為無鈣離子培養(yǎng)基，B、C、D組分別加入1mM、2mM、4mM氯化鈣，E、F、G組為C組中分別加入鈣敏感受體特異性抗體、AMD3100、抗CXCR4抗體。培養(yǎng)至第3代，RT-PCR和Western Blot測定各組CXCR4 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)水平，遷移試驗觀察各組BMSCs向SDF-1α的趨化能力。

15、>　　結(jié)果：
　　1、RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示:US組BMSCs CXCR4 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的水平與對照組相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異（P＞0.05），UM組BMSCs CXCR4 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的水平較US組和對照組明顯升高（P＜0.05），而UMC組BMSCs CXCR4 mRNA轉(zhuǎn)錄和蛋白表達(dá)的水平較UM組明顯降低(P＜0.05)。
　　2、熒光顯微鏡觀察結(jié)果顯示:US組細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度與對

16、照組相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，而UM組細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度明顯高于US組和對照組(P＜0.05）。
　　3、遷移試驗結(jié)果顯示:US組向SDF-1α的移行細(xì)胞數(shù)(22.4±2.2)與對照組(20.5±2.3)相比沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05），UM組向SDF-1α的移行細(xì)胞數(shù)（53.1±3.8）明顯多于US組和對照組(P＜0.05)，而UMC組(35.2±3.1)、UMA組(32.5±2.8)和UMCX組(30.7±2.9)向

17、SDF-1α的移行細(xì)胞數(shù)較UM組明顯減少(P＜0.05)。
　　4、RT-PCR和Western Blot結(jié)果顯示:CXCR4mRNA轉(zhuǎn)錄水平與蛋白表達(dá)水平，與A組相比，B、C、D組顯著上升呈濃度依賴性(P＜0.05)，與C組相比，E組顯著下調(diào)(P＜0.05）。遷移試驗結(jié)果顯示:與A組（40.3±8.8）相比，C組(82.4±12.5)向SDF-1α的遷移細(xì)胞數(shù)增加(P＜0.05)，與C組相比，E組(52.3±10.5)、F組(4

18、7.9±9.5)、G組(46.2±6.5)向SDF-1α的遷移細(xì)胞數(shù)減少(P＜0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、UM可以促進(jìn)BMSCs的鈣離子內(nèi)流，同時促進(jìn)CXCR4的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，后者可能與鈣離子的內(nèi)流增加有關(guān)。
　　2、在一定范圍內(nèi)增加培養(yǎng)液中鈣離子的濃度，可以促進(jìn)BMSCs CXCR4的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，同時增加其向SDF-1α的移行，后者可能與鈣敏感受體的激活和CXCR4的表達(dá)增加有關(guān)。
　　3、超聲微泡預(yù)處理可