異基因骨髓間充質干細胞早期局部移植修復堿燒傷角膜的研究.pdf

1、目的：進行骨髓間充質干細胞(Bone marrow-derived mesenchymal stem cells，MMSCs)的分離、純化和鑒定；研究MMSCs同種異基因移植后的生存狀況和對受體免疫狀態(tài)的影響，探討局部結膜下行MMSCs異基因移植用于治療眼表創(chuàng)傷疾病的可行性；研究局部結膜下行MMSCs異基因移植修復中、重度堿燒傷角膜的可行性，并探討其可能的發(fā)生機制。 方法： 1.幼年SD大鼠10只。采用貼壁篩選法分離SD

2、大鼠骨髓的間充質干細胞，反復傳代對細胞進行擴增、純化。鑒定：顯微鏡下觀察各代細胞的形態(tài)、排列形式；選擇第三代貼壁細胞，誘導其向脂肪樣細胞、骨樣細胞分化；流式細胞術檢測細胞表面的免疫分子CD29、CD44、CD90、CD31、CD34、CD45的表達。 2.成年SD大鼠20只，MMSCs移植組10只，培養(yǎng)液對照組10只。體外DiI熒光標記MMSCs。表面麻醉下在鼻側、顳側結膜下各注入100μl的DiI-MMSCs細胞懸液，密度為5

3、×103個/μl；對照組10只，同樣方法注入200μL的DMEM-F12培養(yǎng)液。移植后4周共聚焦熒光顯微鏡下(DAPI復染細胞核)追蹤MMSCs在體內存活情況，觀察受體鼠生長狀況和角膜、虹膜、晶體等眼部情況，RT-PCR法比較兩組大鼠角膜免疫分子MHC-II的mRNA的表達差異。 3.建立中度和重度角膜堿燒傷模型。中度角膜堿燒傷的MMSCs移植分組：模型+MMSCs移植組40只(其中CM-DiI標記的MMSC移植為10只)，燒傷

4、后1小時移植，細胞濃度為5×103個/μl；模型+培養(yǎng)液組(對照組)30只。移植后3天、2周、4周觀察角膜透明度、新生血管。移植后4周行角膜組織HE染色、免疫熒光法共聚焦顯微鏡下觀察MMSCs的遷移，角膜上皮細胞特異性標記CK12、Cx43的表達及分布。RT-PCR法檢測EGF、IL-RA的表達。Westernblotting分析E-cadherin的表達。 重度角膜堿燒傷的MMSCs移植分組：模型+MMSC移植組28只(其中C

5、M-DiI熒光標記MMSCs移植為10只)；模型+培養(yǎng)液組(對照組)18只。移植后3天、2周、4周觀察角膜透明度、新生血管。移植后4周行角膜組織HE染色、免疫熒光法共聚焦顯微鏡下觀察角膜上皮細胞特異性標記CK12、Cx43的表達及分布。RT-PCR分析IL-1RA的表達。 結果： 1.貼壁細胞呈間質細胞特性：呈梭形，漩渦狀排列。VonKossa染色、油紅染色貼壁細胞呈骨樣細胞及脂肪樣細胞分化。流式細胞儀顯示細胞表面的免疫

6、分子的表達：CD29(99.19％)、CD44(98.34％)、CD90(97.94％)；CD31(0.15％)、CD34(0.69％)、CD45(1.21％)。 2.移植4周后大量的DiI-MMSCs存活于結膜下、角膜緣，結構完整，生長良好。受體鼠全身情況良好，眼局部無排斥反應發(fā)生。RT-PCR結果顯示受體鼠角膜表達MHC-II，對照組未表達。 3.中度角膜堿燒傷的MMSCs移植結果：與對照組比較，移植后2周、4周移植

7、組角膜透明度改善(P<0.05)、新生血管減少(P<0.05)。HE染色顯示角膜上皮層有3-4層細胞，基質層可見少量新生血管，炎性細胞。共聚焦顯微鏡下見角膜緣處DiI-MMSCs少量表達CK12、Cx43；近角膜中央處存在MMSCs，未表達CK12、Cx43；角膜中央未見MMSCs。2周和4周時移植組EGF、IL-1RA高表達，其中2周時EGF的表達和IL-1RA的表達差異明顯。4周時E-cadherin低表達，3天和2周時未見表達E-

8、cadherin。 重度角膜堿燒傷的MMSCs移植結果：與對照組比較，4周時移植組角膜新生血管減少(P<0.05)，而透明度未見改善。HE染色顯示上皮層中少量基底細胞，新生血管較少，少量炎細胞浸潤。共聚焦熒光顯微鏡下見角膜緣處少量DiI-MMSCs，未表達CK12、Cx43。角膜近中央?yún)^(qū)和中央?yún)^(qū)未見遷移的MMSCs。RT-PCR顯示，移植組2周、4周時IL-1RA高表達，其中2周時差異明顯。 結論： 1.本實驗從

9、骨髓中分離的貼壁細胞為骨髓間充質干細胞，純度高。貼壁篩選和反復傳代法是一種較理想的骨髓間充質干細胞的提純方法。 2.局部結膜下行MMSCs異基因移植用于治療眼表創(chuàng)傷疾病是安全可行的，有利于創(chuàng)建一種細胞來源廣泛、無免疫排斥、微創(chuàng)的治療眼表創(chuàng)傷疾病的新手段。 3.早期局部結膜下行異基因MMSCs移植可以抑止堿燒傷角膜表面新生血管生成，促進中度堿燒傷角膜修復。MMSCs發(fā)生遷移和分化，取決于局部微環(huán)境的改變。MMSCs的作用機