體外上調(diào)SDF-1-CXCR4軸對BMSCs遷移的影響.pdf

1、目的:提取Sprague-Dawley大鼠來源的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells，BMSCs)，進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)，保證充足及穩(wěn)定的細(xì)胞來源。構(gòu)建慢病毒載體，并在體外感染BMSCs。獲得過表達(dá)CXCR4的BMSCs。體外實(shí)驗(yàn)探討上調(diào)SDF-1/CXCR4軸對BMSCs遷移效率的影響。為體內(nèi)實(shí)驗(yàn)提供合理有效的工具。
　　方法:全骨髓貼壁法提取BMSCs后進(jìn)行體外細(xì)胞培養(yǎng)，并分為過表達(dá)組

2、(CXCR4-GFP-BMSCs)、空病毒組(GFP-BMSCs)及普通干細(xì)胞組(BMSCs);構(gòu)建攜帶CXCR4目的基因及綠色熒光蛋白基因的慢病毒載體，利用PCR及測序方法確定載體攜帶目的基因CXCR4，并對慢病毒進(jìn)行包裝及滴度檢測;慢病毒載體感染BMSCs，熒光顯微鏡下觀察病毒感染效率，獲得最佳感染復(fù)數(shù)。利用RT-PCR和Western blot檢測上調(diào)的CXCR4表達(dá)水平;使用不同濃度的SDF-1(0、50、100、200)ng/

3、ml作用于正常BMSCs，應(yīng)用Transwell實(shí)驗(yàn)，觀察BMSCs細(xì)胞遷移效率。選用最佳SDF-1濃度趨化不同CXCR4表達(dá)的干細(xì)胞，觀察不同CXCR4表達(dá)對干細(xì)胞遷移效率的影響。
　　結(jié)果:①體外全骨髓提取培養(yǎng)的BMSCs形態(tài)成紡錘形。第3代后，細(xì)胞形成趨于均一，呈旋渦狀生長;②體外成功構(gòu)建慢病毒載體，通過PCR及基因測序，驗(yàn)證攜帶CXCR4目的基因。包裝后檢測病毒滴度為1×108Tu/ml;③過表達(dá)組慢病毒轉(zhuǎn)染的最佳感染值M

4、OI=30，感染效率達(dá)80％，Western Blot及RT-PCR均提示CXCR4高表達(dá);④不同濃度的SDF-1(0、50、100)ng/ml作用于正常BMSCs，其遷移效率隨SDF-1濃度升高而增高，而高濃度100ng/ml和200ng/ml時(shí)遷移效率無明顯差異。⑤同一SDF-1濃度下，過表達(dá)CXCR4的BMSCs遷移效率明顯高于空病毒組及普通BMSCs組。
　　結(jié)論:①利用全骨髓貼壁法分離培養(yǎng)及細(xì)胞傳代后可獲得高純度的BMS