缺氧預(yù)處理MSCs移植對(duì)心肌梗死區(qū)SDF-1-CXCR4軸表達(dá)變化的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、目的：研究骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)及缺氧預(yù)處理MSCs在SD大鼠急性心肌梗死模型梗死局部注射后梗死區(qū)域基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1(SDF-1)/CXCR4表達(dá)變化以及對(duì)梗死后心功能改善的作用,并對(duì)其機(jī)理及意義進(jìn)行探討。
　　 方法：全骨髓法分離培養(yǎng)SD大鼠MSCs,通過(guò)體外培養(yǎng)和連續(xù)傳代達(dá)到純化和擴(kuò)增MSCs目的。倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化情況;利用四唑鹽比色法(MTT)測(cè)定MSCs的生長(zhǎng)曲線;流式細(xì)胞儀(FCM)鑒定MSCs膜

2、抗原。其中部分MSCs在術(shù)前24h作預(yù)缺氧處理,體外實(shí)驗(yàn)分別測(cè)定普通培養(yǎng)MSCs和預(yù)缺氧培養(yǎng)MSCs中的SDF-1和CXCR4含量。128只SD大鼠,隨機(jī)分為MSCs移植組(MSCs組,n=32)、缺氧預(yù)處理MSCs移植組(預(yù)處理MSCs組,n=32),結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支制備急性心肌梗死模型,結(jié)扎左前降支冠狀動(dòng)脈10min后,在梗死區(qū)域、梗死區(qū)邊緣局部注射共約0.5×106uL-1個(gè)MSCs和預(yù)缺氧處理后的MSCs。取32只為對(duì)照組,

3、僅結(jié)扎左前降支冠狀動(dòng)脈。其余32只SD大鼠作為假手術(shù)組。心肌梗死前及梗死后28d采用超聲心動(dòng)圖測(cè)量LVDd、LVDs、EF三項(xiàng)反應(yīng)心臟功能指標(biāo)。分別于術(shù)后1d、7d、14d和28d每組各處死8只大鼠取心臟組織作免疫組化、RT-PCR、常規(guī)病理染色等項(xiàng)目檢查。測(cè)定不同時(shí)期SDF-1/CXCR4在各組梗死心肌局部表達(dá)值的變化,同時(shí)測(cè)定心肌梗死面積、梗死區(qū)心室壁厚度和心室肌內(nèi)微血管密度。
　　 結(jié)果：成功培養(yǎng)MSCs,取第4代MSCs

4、進(jìn)行FCM檢測(cè),CD45、CD90、CD29陽(yáng)性率分別為1.50％、99.18％、97.70％。MSCs體外試驗(yàn)顯示有SDF-1mRNA和CXCR4mRNA表達(dá),其中SDF-1mRNA缺氧預(yù)處理組表達(dá)是正常MSCs的1.20倍,而CXCR4mRNA表達(dá)值是正常MSCs組的1.47倍。MSCs體外SDF-1和CXCR蛋白熒光定量SDF-1低氧組為108.54±1.79,正常組為26.08±1.28(P＜0.05);CXCR4低氧組為135

5、.50±1.19,正常組為28.13±1.02(P＜0.05)。成功建立SD大鼠急性心肌梗死模型,手術(shù)存活率為95％。免疫組織化學(xué)及激光共聚焦顯示,移植MSCs后SDF-1和CXCR4在梗死周邊區(qū)域注射細(xì)胞處及局部血管壁發(fā)生高表達(dá),且SDF-1mRNA、CXCR4mRNA在移植后24h后達(dá)高峰,持續(xù)約7d,以后逐漸遞減;SDF-1、CXCR蛋白熒光定量在移植后7d達(dá)高峰,以后逐漸遞減。其中預(yù)處理MSCs組SDF-1和CXCR4的表達(dá)在有

6、各時(shí)間點(diǎn)又均顯著高于MSCs組(P＜0.05)對(duì)照組心梗后SDF-1和CXCR4值升高,與假手術(shù)組比較有顯著性差異(P＜0.05),假手術(shù)組心肌組織中有SDF-1和CXCR4的少量表達(dá)。心肌梗死后28d時(shí)超聲心動(dòng)圖結(jié)果表明MSCs組和預(yù)處理MSCs組LVDd、LVDs、EF三項(xiàng)反應(yīng)心臟功能指標(biāo)均較對(duì)照組明顯改善(P＜0.05),其中預(yù)處理MSCs組又顯著優(yōu)于MSCs組(P＜0.05)。與對(duì)照組比較,梗死面積縮小程度最顯著為預(yù)處理MSCs

7、組,其次為MSCs組,三者之間均有顯著差異(P＜0.05)。左室前壁厚度在預(yù)處理MSCs組、MSCs組和對(duì)照組依次為3.56±0.45mm、2.88±0.32mm和1.80±0.71mm,各組間差異均有顯著性(P＜0.05)。心肌梗死區(qū)、心肌梗死邊緣區(qū)及正常心肌組織三個(gè)部位CD31新生微血管數(shù)量測(cè)定MSCs組和預(yù)處理MSCs組均較對(duì)照組明顯增加(P＜0.05),其中預(yù)處理MSCs組又顯著高于MSCs組(P＜0.05)。
　　 結(jié)

8、論：全骨髓貼壁法能有效得到分離純化的MSCs,MSCs生長(zhǎng)穩(wěn)定,增殖能力活躍,具有MSCs的一般生物學(xué)特性,可以作為組織工程理想的種子細(xì)胞。MSCs在體外普通或缺氧兩種方法培養(yǎng)條件下SDF-1/CXCR4均有表達(dá),且缺氧預(yù)處理組高于正常培養(yǎng)組,說(shuō)明缺氧條件能促進(jìn)MSCs高表達(dá)SDF-1和CXCR4。MSCs在心肌梗死區(qū)域注射后可提高局部組織內(nèi)SDF-1和CXCR4表達(dá),而經(jīng)預(yù)缺氧處理MSCs移植后局部SDF-1和CXCR4表達(dá)最高,SD

9、F-1和CXCR4在心肌梗死區(qū)域局部的高表達(dá)可能會(huì)誘導(dǎo)外周血、骨髓內(nèi)及其他組織中干細(xì)胞向心肌梗死區(qū)域轉(zhuǎn)移,促進(jìn)新生毛細(xì)血管,這可能是MSCs治療急性心肌梗死的機(jī)制之一,也可能是缺氧預(yù)處理MSCs改善心功能更好的原因之一。未移植MSCs心肌梗死組中梗死區(qū)域局部也有一定SDF-1/CXCR4表達(dá)升高,這可能是心肌梗死后機(jī)體調(diào)動(dòng)外周干細(xì)胞定向遷移參與損傷心肌修復(fù)的途徑之一。在將來(lái)的缺血性心臟病基礎(chǔ)及臨床研究中,可能通過(guò)調(diào)控局部SDF-1/CX