缺氧預(yù)適應(yīng)上調(diào)SDF-1-CXCR4的表達(dá)改善心臟祖細(xì)胞存活的機(jī)制研究.pdf

1、第一部分:
　　 c-kit陽(yáng)性心臟祖細(xì)胞的體外分離培養(yǎng)和純化
　　 目的:探索自成年小鼠心臟組織中分離培養(yǎng)得到c-kit陽(yáng)性心臟祖細(xì)胞(cardiacprogenitorcells，CPCs)的有效方法。方法:無(wú)菌條件下取2月齡成年C57BL/6小鼠心臟，剪碎，經(jīng)膠原酶Ⅳ和胰蛋白酶消化后，置于組織塊培養(yǎng)基(completeexplantmedium，CEM)中培養(yǎng)。培養(yǎng)一段時(shí)間后，收集心肌組織塊周?chē)莱龅男?、圓、亮的細(xì)

2、胞，通過(guò)磁珠分選儀c-kit磁珠抗體陽(yáng)性分選獲得純化的c-kit陽(yáng)性CPCs，然后按2×104/ml的密度種植在多聚賴(lài)氨酸包被的培養(yǎng)皿中，予以心球生長(zhǎng)培養(yǎng)基(cardiosphere-growingmedium，CGM)繼續(xù)培養(yǎng)生長(zhǎng)。導(dǎo)致相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，免疫細(xì)胞化學(xué)染色法及流式細(xì)胞法分析所得細(xì)胞其表面祖細(xì)胞標(biāo)記的表達(dá)。結(jié)果:消化后的心肌組織塊經(jīng)過(guò)10天左右的培養(yǎng)，可見(jiàn)小、圓、亮的細(xì)胞出現(xiàn)在組織塊周?chē)莱龅某衫w維細(xì)胞層上

3、。倒置顯微鏡下觀察分離培養(yǎng)獲得的CPCs可形成“太陽(yáng)狀”集落，可分化成能自發(fā)性搏動(dòng)的心肌細(xì)胞。免疫細(xì)胞化學(xué)染色示分離培養(yǎng)獲得的CPCs其表面c-kit表達(dá)陽(yáng)性。流式細(xì)胞分析顯示經(jīng)過(guò)磁珠分選后c-kit陽(yáng)性率為87.26％，而分選前c-kit表達(dá)陽(yáng)性率僅6.5％。結(jié)論:聯(lián)合利用酶消化和磁珠分選法可以成功地從成年小鼠心臟組織中分離培養(yǎng)得到高純度的c-kit陽(yáng)性心臟祖細(xì)胞。
　　 第二部分:
　　 缺氧預(yù)適應(yīng)時(shí)程對(duì)體外培養(yǎng)的C

4、PCs分子生物學(xué)功能的影響
　　 目的:觀察缺氧不同時(shí)間對(duì)體外培養(yǎng)的c-kit陽(yáng)性CPCs的活力及分子生物學(xué)功能的影響，確定本研究系統(tǒng)中最佳的缺氧預(yù)適應(yīng)時(shí)間。方法:將c-kit+CPCs分為5組，正常氧培養(yǎng)組(Normoxia，Nx)，缺氧培養(yǎng)3小時(shí)組(Hypoxia，Hx3h)，缺氧培養(yǎng)6小時(shí)組(Hx6h)，缺氧培養(yǎng)12小時(shí)(Hx12h)，缺氧培養(yǎng)24小時(shí)(Hx24h)。流式細(xì)胞術(shù)觀察細(xì)胞活力;Westernblot法檢測(cè)HI

5、F-1α，CXCR4，Bcl-2，p-Akt蛋白的表達(dá);ELISA法檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)基上清中SDF-1α、VEGF的分泌量。結(jié)果:流式細(xì)胞檢測(cè)顯示與正常氧環(huán)境培養(yǎng)相比缺氧培養(yǎng)12小時(shí)以?xún)?nèi)對(duì)c-kit+CPCs活力無(wú)顯著影響，其中缺氧培養(yǎng)6小時(shí)細(xì)胞活力最佳(Nx4.67±0.45，Hx6h4.47±0.31;P＞0.05)，但缺氧培養(yǎng)24小時(shí)后細(xì)胞凋亡率顯著增加(Nx4.67±0.45，Hx24h7.43±0.61;P＜0.01)。缺氧培養(yǎng)1

6、2小時(shí)以上細(xì)胞凋亡呈現(xiàn)出逐步上升的趨勢(shì)。Westemblot結(jié)果顯示缺氧培養(yǎng)后HIF-1α和CXCR4，促生存蛋白Bcl-2和p-Akt表達(dá)均較正常氧培養(yǎng)組顯著增加。ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示培養(yǎng)液上清中的SDF-1α、VEGF含量在缺氧培養(yǎng)后也顯著升高。結(jié)論:6小時(shí)是c-kit+CPCs缺氧預(yù)適應(yīng)的最佳時(shí)程，此時(shí)CPCs的存活良好，抗凋亡能力最強(qiáng)。
　　 第三部分:
　　 缺氧預(yù)適應(yīng)對(duì)CPCs遷移和抗凋亡能力的影響及其與S

7、DF-1/CXCR4信號(hào)軸的關(guān)系
　　 目的:探索缺氧預(yù)適應(yīng)6小時(shí)后c-kit+CPCs體外遷移和抗凋亡能力的改變及其與SDF-1α/CXCR4軸的關(guān)系。方法:Transwell小室檢測(cè)細(xì)胞遷移能力，實(shí)驗(yàn)分為4組，正常氧組(Nx)，正常氧+SDF-1α組(Nx+SDF-1α)，缺氧預(yù)適應(yīng)+SDF-1α組(Hx+SDF-1α)，缺氧預(yù)適應(yīng)+SDF-1α+AMD3100組(Hx+AMD+SDF-1α)。缺氧培養(yǎng)并血清剝奪48小時(shí)誘導(dǎo)

8、c-kit+CPCs凋亡。將體外培養(yǎng)的CPCs隨機(jī)分為4組:正常氧組(Nx)，正常氧+AMD3100組(Nx+AMD)，缺氧預(yù)適應(yīng)組(Hx)，缺氧預(yù)適應(yīng)+AMD3100組(Hx+AMD)。Annexin/碘化吡啶(PI)雙染色法流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。結(jié)果:缺氧預(yù)適應(yīng)后c-kit+CPCs遷移能力較正常氧組顯著增加（Nx+SDF-1α341±26，Hx+SDF-1α650±48;P＜0.01）。同樣，當(dāng)缺氧預(yù)適應(yīng)的c-kit+CPCs與

9、AMD3100共孵育時(shí)，這種由缺氧預(yù)適應(yīng)誘發(fā)的CPCs遷移能力增強(qiáng)效應(yīng)大部分被阻滯掉了（Hx+AMD+SDF-1α396±39，Hx+SDF-1α650±48;P＜0.01）。缺氧預(yù)適應(yīng)組CPCs凋亡率明顯低于正常氧培養(yǎng)組(Nx33.29±2.55，Hx21.81±1.67;P＜0.01)，但當(dāng)缺氧預(yù)適應(yīng)的c-kit+CPCs與AMD3100共孵育時(shí)，這種短時(shí)間缺氧誘發(fā)的保護(hù)性作用則基本被抵消了（Hx+AMD30.96±3.07，Hx2

10、1.81±1.67;P＜0.01）。結(jié)論:缺氧預(yù)適應(yīng)能增強(qiáng)c-kit+CPCs的遷移和抗凋亡能力，缺氧預(yù)適應(yīng)誘導(dǎo)的CPCs功能增強(qiáng)依賴(lài)于SDF-1/CXCR4信號(hào)通路信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。
　　 第四部分:
　　 缺氧預(yù)適應(yīng)對(duì)CPCs移植治療急性心肌梗死的影響及其與SDF-1/CXCR4信號(hào)軸的關(guān)系
　　 目的:探索缺氧預(yù)適應(yīng)6小時(shí)的c-kit+CPCs移植治療小鼠急性心肌梗死的療效及其與SDF-1α/CXCR4軸的關(guān)系。方

11、法:結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支建立小鼠急性心肌梗死模型，隨機(jī)分為對(duì)照組(Control)，正常氧組(Nx)，缺氧預(yù)適應(yīng)組(Hx)，缺氧預(yù)適應(yīng)+AMD3100組(Hx+AMD)。對(duì)照組小鼠僅心肌內(nèi)注射無(wú)細(xì)胞的DMEM，3個(gè)實(shí)驗(yàn)組分別心肌內(nèi)注射移植正常氧培養(yǎng)、缺氧預(yù)適應(yīng)和缺氧預(yù)適應(yīng)+AMD3100處理后的c-kit+CPCs。細(xì)胞移植后7天心臟超聲檢查小鼠心功能，隨后處死小鼠取心臟標(biāo)本并做相應(yīng)檢查。結(jié)果:心臟超聲檢查結(jié)果顯示c-kit+CPCs移

12、植組心功能明顯優(yōu)于對(duì)照組(P＜0.01)。缺氧預(yù)適應(yīng)組心功能優(yōu)于正常氧組（P＜0.01），缺氧預(yù)適應(yīng)+AMD3100組心功能與正常氧組比較無(wú)顯著性差異。缺氧預(yù)適應(yīng)組梗死面積小于對(duì)照組及正常氧組（Control49.6±5.9;Nx37.9±5.0;Hx25.8±5.4;P＜0.01）;缺氧預(yù)適應(yīng)+AMD3100組心梗面積小于對(duì)照組（Hx+AMD37.5±3.7;P＜0.01），其梗死面積大于缺氧預(yù)適應(yīng)組(P=0.013)，但與正常氧組比

13、較沒(méi)有顯著差異。TUNEL熒光染色結(jié)果顯示缺氧預(yù)適應(yīng)組細(xì)胞凋亡明顯低于其他組(Control81.2±11.3;Nx47.8±6.5;Hx19.6±7.5;P＜0.01)，當(dāng)缺氧預(yù)適應(yīng)的細(xì)胞與AMD3100共孵育時(shí)，缺氧預(yù)適應(yīng)的保護(hù)性效應(yīng)就被抵消了（Hx19.6±7.5;Hx+AMD42.4±7.7;P=0.004）。缺氧預(yù)適組植入的CPCs凋亡率較正常氧組及缺氧預(yù)適應(yīng)+AMD3100組明顯降低（Hx30.9±5.1;Nx43.8±4.