miRNA-290族對(duì)MSC的SDF-1-CXCR4信號(hào)軸調(diào)節(jié)作用及對(duì)其生物學(xué)功能的影響.pdf

1、第一部分、MSCs兩種分離培養(yǎng)方法及其培養(yǎng)液中的VEGF、SDF-1α濃度比較
　　 目的:通過(guò)兩種分離培養(yǎng)方法所得MSCs的生長(zhǎng)特征和微環(huán)境的比較，選擇一種可以快速、安全、高效地為臨床和試驗(yàn)提供大量?jī)?yōu)質(zhì)MSCs的方法。
　　 方法:提取C57BL/c小鼠的骨髓，分別作密度梯度離心法和全骨髓貼壁培養(yǎng)分離法分離培養(yǎng)MSCs，并比較各自所得細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線、培養(yǎng)液中的VEGF、SDF-1α濃度，評(píng)價(jià)方法優(yōu)劣，也對(duì)所得細(xì)胞作了成

2、脂、成骨分化，和流式細(xì)胞儀鑒定其表面抗原。
　　 結(jié)果:與密度梯度離心法相比，全骨髓貼壁分離法所得原代細(xì)胞有較快的生長(zhǎng)速度，較短的生長(zhǎng)周期;培養(yǎng)液中VEGF和SDF-1α濃度也稍高于密度梯度離心法;兩種方法所得細(xì)胞均可成脂成骨分化，細(xì)胞表面表達(dá)CD29+、CD31-、 CD34-、CD45-。
　　 結(jié)論:全骨髓貼壁培養(yǎng)法可以快速、方便、有效地為臨床和實(shí)驗(yàn)提供大量MSCs，這種方法所得細(xì)胞的培養(yǎng)為環(huán)境優(yōu)于密度梯度離心法，

3、減少了對(duì)細(xì)胞功能的損害。
　　 第二部分、miR-290族對(duì)MSCs的CXCR4基因的調(diào)節(jié)作用以及對(duì)其生物功能的影響
　　 目的:尋找干細(xì)胞特異性miRNAs調(diào)節(jié)CXCR4受體，提高M(jìn)SCs的遷移能力。
　　 方法:生物信息分析miRNA-290族可能靶向作用于CXCR4，利用miRNA-290族模擬物、抑制物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MSCs，檢測(cè)CXCR4的mRNA表達(dá)和蛋白水平，發(fā)現(xiàn)miRNA-290族可已上調(diào)或下調(diào)CXCR

4、4表達(dá);作重組基因雙熒光報(bào)告法檢測(cè)靶基因;miRNA-290族模擬物、抑制物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染MSCs，作Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)其遷移能力，PI單染色法、MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞增殖情況。
　　 結(jié)果:miRNA-290族模擬物可以抑制CXCR4表達(dá)，抑制物可以上調(diào)CXCR4表達(dá);miRNA-290族可以靶向作用于CXCR4; miRNA-290族模擬物促進(jìn)MSCs增殖，miRNA-290族抑制物抑制了MSCs增殖;miRNA-290族模擬

5、物抑制了MSCs遷移能力，miRNA-290族抑制物提高了MSCs遷移能力。
　　 結(jié)論:miRNA-290族可以調(diào)節(jié)CXCR4的表達(dá)，通過(guò)靶基因雙熒光報(bào)告體系說(shuō)明miRNA-290是直接靶向作用于CXCR4的;miRNA-290族可以調(diào)節(jié)MSCs的遷移能力;miRNA-290族對(duì)MSCs生長(zhǎng)增殖產(chǎn)生了一定影響關(guān)鍵詞:miRNA-290族;CXCR4;細(xì)胞周期。
　　 第三部分miRNA-290族對(duì)SDF-1/CXCR4

6、軸的下游信號(hào)PI3K/akt的影響及意義目的:探討下調(diào)MSCs的miRNA-290族的表達(dá)后對(duì)SDF-1/CXCR4軸的下游PI3K/akt的影響，以及對(duì)MSCs表達(dá)VEGF、MMP-9和抗凋亡能力產(chǎn)生的影響，方法:在同一濃度SDF-1α、PI3K特異抑制物或CXCR4抑制物干預(yù)miRNA-290族抑制物瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的MSCs;western blot檢測(cè)SDF-1α/CXCR4信號(hào)軸下游的PI3K/akt、和VEGF、MMP-9的表達(dá)情況

7、;在無(wú)胎牛血清的情況下培養(yǎng)上述細(xì)胞，利用Annexin V/PI雙染檢測(cè)MSCs凋亡情況結(jié)果:SDF-1可以促進(jìn)SDF-1/CXCR4下游PI3K/AKT的表達(dá)，這一作用在anti-miRNA-290組表現(xiàn)更加明顯，且被CXCR4拮抗劑所抑制;SDF-1處理組的VEGF和MMP-9的表達(dá)高于未處理組，anti-miRNA-290轉(zhuǎn)染組的VEGF和MMP-9的表達(dá)高于SDF-1PI3K處理組，而PI3K抑制物處理組VEGF和MMP-9的表