轉(zhuǎn)染CXCR4基因?qū)Υ笫髿夤苌掀ぜ?xì)胞向SDF-1趨化、遷移和增殖作用的研究.pdf

1、目的：
　　 氣管組織工程技術(shù)是近年來(lái)氣管替代研究的熱點(diǎn)，其研究主要包括細(xì)胞外基質(zhì)（生物材料）、種子細(xì)胞、再血管化和上皮再生等方面，其中上皮再生是最具挑戰(zhàn)性的難題之一。要構(gòu)建一個(gè)有活性的組織工程化氣管，其粘膜上皮的功能，尤其是纖毛運(yùn)動(dòng)能力是一個(gè)必須考慮的問(wèn)題。Adams等在大鼠氣管移植中發(fā)現(xiàn)，呼吸道粘膜上皮的覆蓋情況與氣道閉塞呈負(fù)相關(guān)，同時(shí)在促進(jìn)與宿主組織結(jié)合、防止肉芽組織形成等方面發(fā)揮作用。因此，如果能在體外將粘膜上皮覆蓋在替

2、代物內(nèi)表面是很有必要的，缺乏完整的上皮覆蓋被認(rèn)為是疤痕形成和管腔狹窄的重要因素。如何早期地誘導(dǎo)替代物表面的氣管粘膜上皮覆蓋并恢復(fù)其功能，尤其是上皮爬行的速度和纖毛運(yùn)動(dòng)的能力是一個(gè)必須考慮關(guān)鍵問(wèn)題。1.大鼠氣管上皮在體損傷修復(fù)過(guò)程中CXCR4的表達(dá)。5-FU屬抗嘧啶類代謝藥，通過(guò)抑制胸腺嘧啶核苷酸合成酶而抑制DNA的合成，可造成細(xì)胞周期內(nèi)細(xì)胞的變性壞死，主要作用于S期，對(duì)增殖細(xì)胞的各期均有作用，但對(duì)G0期細(xì)胞不敏感。利用5-FU對(duì)G0期細(xì)

3、胞不造成損傷這一特點(diǎn),更利于研究處于G0期的干細(xì)胞。由于是在體損傷模型，氣管血運(yùn)良好，其修復(fù)過(guò)程更接近于正常的體內(nèi)生理過(guò)程,而且具有效果容易觀察、對(duì)細(xì)胞損傷作用確切的優(yōu)點(diǎn)。我們利用此動(dòng)物模型研究氣管損傷修復(fù)過(guò)程中趨化因子受體CXCR4的表達(dá)變化情況。2.CXCR4慢病毒表達(dá)載體的構(gòu)建。以病毒為載體的細(xì)胞感染方式具有較高的轉(zhuǎn)染效率，且目的基因在導(dǎo)入靶細(xì)胞后在細(xì)胞內(nèi)進(jìn)行病毒包裝擴(kuò)增，有利于進(jìn)行基因的功能學(xué)研究。慢病毒載體是近幾年發(fā)展起來(lái)的基

4、因工程載體，其最大的特點(diǎn)是能夠在體內(nèi)外轉(zhuǎn)染分裂和非分裂的細(xì)胞，是一種具有自我失活功能、無(wú)免疫反應(yīng)的高效的基因傳遞工具，并且具有容納外源性目的基因片段大、宿主范圍廣泛、重組機(jī)會(huì)低、可將所攜帶的目的基因整合到宿主染色體中并穩(wěn)定長(zhǎng)期表達(dá)并隨親本的繁殖將外源基因傳遞給子代發(fā)揮作用等優(yōu)。本實(shí)驗(yàn)用四質(zhì)粒感染包裝細(xì)胞產(chǎn)毒并完成滴度測(cè)定，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。3.CXCR4慢病毒侵染大鼠氣管上皮細(xì)胞后的表達(dá)。CXCR4是介導(dǎo)SDF-1行使功能的GTP蛋

5、白耦聯(lián)的跨膜受體(GPCR)，其不僅表達(dá)于細(xì)胞表面，也可在胞漿中檢測(cè)到，屬于G蛋白耦連受體家族，廣泛地表達(dá)在許多組織和器官上，其主要功能性表達(dá)細(xì)胞為嗜中性細(xì)胞、單核-巨噬細(xì)胞。近年來(lái)骨髓干細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞、肌細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞的表達(dá)研究是其研究熱點(diǎn)，氣管上皮細(xì)胞的表達(dá)研究未見(jiàn)報(bào)道。4.轉(zhuǎn)染CXCR4基因?qū)夤苌掀ぜ?xì)胞向SDF-1趨化遷移和增殖作用的研究。SDF-1和其受體CXCR4廣泛地、組成性地表達(dá)于各種細(xì)胞和組織中，二者相互作用引起細(xì)胞的

6、骨架重構(gòu)、牢固地黏附于內(nèi)皮細(xì)胞和定向遷移，并能介導(dǎo)各種特定的信號(hào)以產(chǎn)生各種不同的生理和病理效應(yīng)。近年來(lái)有關(guān)于SDF-1/ CXCR4軸通過(guò)干細(xì)胞遷移修復(fù)受損病灶的報(bào)道逐漸增多，如在缺血的腦組織、心肌組織、肢體肌肉組織中，趨化因子SDF-1明顯升高，促使成體干細(xì)胞定向遷移至病灶內(nèi)，加速受損組織的修復(fù)再生。有關(guān)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子SDF-1及受體CXCR4在氣管上皮損傷修復(fù)的研究報(bào)道很少。我們?cè)谟米泽w肺組織瓣完成氣管替代的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上，想一步

7、了解SDF-1/CXCR4通路在氣管上皮細(xì)胞修復(fù)、遷移、增殖中作用。
　　 方法：
　　 1.SD大鼠16只，按0.12mg/g用量腹腔注射氯胺酮，頸部切口暴露氣管，于氣管的3、6、9點(diǎn)滴注藥物，對(duì)照組PBS200ul，實(shí)驗(yàn)組5-氟尿嘧啶100ul。30min后，生理鹽水沖洗氣管，切取2個(gè)氣管環(huán)作為0h標(biāo)本。計(jì)時(shí)并縫合傷口。設(shè)3、6、12、24、48h時(shí)間點(diǎn)，每個(gè)時(shí)間點(diǎn)切取氣管環(huán)。常規(guī)HE染色和免疫組化法觀察CXCR4表

8、達(dá)變化。2.從含有CXCR4基因的質(zhì)?？寺∧０逯?，利用PCR方法克隆目的基因，將目的基因純化后與克隆載體pGEM-T進(jìn)行連接，選擇酶切鑒定和測(cè)序正確的克隆進(jìn)行雙酶切(AgeI+EcoRI)、純化定向連接或者重組到表達(dá)載體上，其產(chǎn)物轉(zhuǎn)化細(xì)菌感受態(tài)細(xì)胞，對(duì)長(zhǎng)出的克隆進(jìn)行酶切鑒定，證明目的基因已經(jīng)連入到表達(dá)載體上。將構(gòu)建好的融合蛋白表達(dá)載體進(jìn)行超純?nèi)?nèi)毒素抽提。四質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞:FUGW-CXCR4、VSVG、RSV-REV、pMDLg

9、/RRE，收獲含病毒的上清貯存。3.聯(lián)合胰酶和Dispase酶法分離、培養(yǎng)大鼠原代氣管上皮細(xì)胞，掃描電鏡鑒定。免疫熒光法和流式細(xì)胞儀檢測(cè)在氣管上皮細(xì)胞CXCR4的表達(dá)情況和表達(dá)強(qiáng)度。CXCR4慢病毒侵染氣管上皮細(xì)胞，免疫熒光、流式細(xì)胞儀、Real TimePCR和Western檢測(cè)其表達(dá)情況。4.利用Transwell趨化實(shí)驗(yàn)、MTT細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)來(lái)測(cè)定SDF-1/CXCR-4軸對(duì)于介導(dǎo)CXCR4基因轉(zhuǎn)染后的定向趨化和增殖作用。通過(guò)測(cè)定侵

10、染后細(xì)胞的胞內(nèi)鈣流變化檢測(cè)CXCR4對(duì)SDF-1和其抑制劑AMD3100的活化狀態(tài)。
　　 結(jié)果：
　　 1.實(shí)驗(yàn)大鼠均存活48h，完成實(shí)驗(yàn)后處死，無(wú)實(shí)驗(yàn)中死亡。實(shí)驗(yàn)組:5-FU作用3h后，氣管環(huán)上皮細(xì)胞開(kāi)始脫落，光鏡下假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮局部脫落，暴露出基底膜;12h后氣管環(huán)的上皮全部脫落，殘留間隔分布的類似裸核的細(xì)胞，呈釘狀位于基底膜上。去除5-FU后6h，細(xì)胞數(shù)目逐漸增多，大部分為扁平狀，隨著恢復(fù)時(shí)間延長(zhǎng)至12h，上

11、皮細(xì)胞由扁平漸變?yōu)榱⒎綘??；謴?fù)24h，上皮細(xì)胞呈立方狀，并連接成片;恢復(fù)48h，氣管上皮接近恢復(fù)假?gòu)?fù)層結(jié)構(gòu)。對(duì)照組:各時(shí)間段的氣管環(huán)經(jīng)顯微鏡下觀察，纖毛擺動(dòng)良好，光鏡下未見(jiàn)異常。免疫組化結(jié)果顯示:(1)正常氣管粘膜上皮的CXCR4表達(dá)較低。(2)氣管上皮損傷后修復(fù)的早、中和后期的氣管上皮細(xì)胞中CXCR4的表達(dá)較低。2.根據(jù)Genebank(GeneID:2735718)，CXCR4基因編碼區(qū)長(zhǎng)度1100bp。電泳圖見(jiàn)PCR產(chǎn)物中擴(kuò)增出相

12、同大小目的基因條帶。酶切陽(yáng)性克隆和表達(dá)載體均可見(jiàn)目的基因條帶，CXCR4基因成功包裝到慢病毒載體。3.分離的氣管上皮細(xì)胞為圓形，折光度好，4,5d后細(xì)胞增殖，形成片狀的細(xì)胞團(tuán)。掃描電鏡放大可見(jiàn)特異性纖毛由細(xì)胞頂膜伸出，部分集結(jié)成束，為氣管纖毛上皮細(xì)胞。免疫熒光結(jié)果顯示:細(xì)胞膜表面未檢測(cè)到明顯的綠色的FITC標(biāo)記，表明細(xì)胞膜上CXCR4表達(dá)非常低。流式細(xì)胞儀檢測(cè)有3％的細(xì)胞中CXCR4蛋白質(zhì)有一定強(qiáng)度的表達(dá)。CXCR4慢病毒侵染氣管上皮細(xì)

13、胞后，病毒包裝效率較高。同時(shí)，獲得的慢病毒上清可高效感染氣管上皮細(xì)胞，熒光顯微鏡下可觀察到大量綠色熒光，感染效率為50％左右。感染后靶細(xì)胞中CXCR4有穩(wěn)定高表達(dá)，RT-PCR顯示CXCR4溶解曲線和擴(kuò)增曲線顯示峰值較高，形狀比較銳利，曲線斜率較大，說(shuō)明CXCR4表達(dá)量較高，產(chǎn)物比較特異，擴(kuò)增效率較高。4.MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示隨著SDF-1濃度增加，兩組的吸光度值都增加。當(dāng)SDF-1濃度大于100nM時(shí)，轉(zhuǎn)染CXCR4的細(xì)胞較正常細(xì)胞增加

14、更顯著，P＜0.05。Transwell實(shí)驗(yàn)顯示從上室遷移至下室的細(xì)胞數(shù)隨著SDF-1濃度的增加而增加，在SDF-1100nm時(shí)，增加的數(shù)量更顯著。從反應(yīng)曲線看，隨著濃度增加，SDF-1對(duì)細(xì)胞內(nèi)鈣流的釋放有明顯的促進(jìn)作用;CXCR4受體拮抗劑AMD3100對(duì)氣管上皮細(xì)胞內(nèi)的鈣流的釋放有明顯的抑制作用。
　　 結(jié)論：
　　 1.通過(guò)成功構(gòu)建的在體氣管損傷、修復(fù)的動(dòng)物模型，觀察了氣管上皮細(xì)胞修復(fù)過(guò)程中CXCR4的表達(dá)情況。C

15、XCR4被認(rèn)為是一種新的干細(xì)胞表面標(biāo)記物，氣管干細(xì)胞的研究尚處于起始階段。本實(shí)驗(yàn)常規(guī)的免疫組化方法結(jié)果顯示:正常氣管粘膜上皮的CXCR4表達(dá)較低;氣管上皮損傷后修復(fù)的早、中和后期的氣管上皮細(xì)胞中CXCR4表達(dá)也沒(méi)有明顯增加。其原因可能有:(1)正常氣管上皮的CXCR4基礎(chǔ)表達(dá)較低，損傷修復(fù)過(guò)程中亦沒(méi)有出現(xiàn)高表達(dá)。(2)氣管上皮細(xì)胞中的干細(xì)胞的含量也較低。(3)CXCR4是跨膜蛋白受體，主要在細(xì)胞膜表達(dá)，本實(shí)驗(yàn)使用的常規(guī)的免疫組化方法或抗

16、體不能檢測(cè)或真實(shí)反映氣管上皮的CXCR4表達(dá)情況，應(yīng)該從rnRNA水平或蛋白表達(dá)水平檢測(cè)其表達(dá)情況。
　　 2.慢病毒載體是近幾年發(fā)展起來(lái)的基因工程載體，其最大的特點(diǎn)是能夠在體內(nèi)外轉(zhuǎn)染分裂和非分裂的細(xì)胞，是一種具有自我失活功能、無(wú)免疫反應(yīng)的高效的基因傳遞工具，具有容納外源性目的基因片段大、宿主范圍廣泛、重組機(jī)會(huì)低、可將所攜帶的目的基因整合到宿主染色體中并穩(wěn)定長(zhǎng)期表達(dá)，并隨親本的繁殖將外源基因傳遞給子代發(fā)揮作用等優(yōu)點(diǎn)。本實(shí)驗(yàn)用四質(zhì)

17、粒感染包裝細(xì)胞產(chǎn)毒并完成滴度測(cè)定，為進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)奠定基礎(chǔ)。
　　 3.氣管上皮是假?gòu)?fù)層纖毛柱狀上皮，僅有一層細(xì)胞，通過(guò)兩種酶的聯(lián)合消化法，克服各自的缺點(diǎn)，所得的細(xì)胞狀態(tài)好，細(xì)胞的貼壁和增值都較強(qiáng)，并通過(guò)掃描電鏡鑒定，觀察到了氣管上皮細(xì)胞特征性的纖毛結(jié)構(gòu)，成功地培養(yǎng)了氣管上皮細(xì)胞并完成了傳代，為下一步的細(xì)胞水平研究奠定了基礎(chǔ)。氣管上皮細(xì)胞的CXCR4表達(dá)研究較少，通過(guò)本實(shí)驗(yàn)的免疫熒光和流式細(xì)胞儀檢測(cè)，氣管上皮細(xì)胞膜的CXCR4表達(dá)和

18、含量非常低，不是其主要的功能細(xì)胞，也可能隨著體外的培養(yǎng)而降低了表達(dá)。通過(guò)慢病毒侵染后，CXCR4產(chǎn)物比較特異，表達(dá)含量明顯增高。慢病毒包裝系統(tǒng)操作比較簡(jiǎn)單，轉(zhuǎn)染成功率高，穩(wěn)定性好。
　　 4.正常情況下，僅少量氣管上皮表達(dá)CXCR-4受體。有研究發(fā)現(xiàn)在肺組織損傷的微環(huán)境中，SDF-1表達(dá)明顯增高。研究表明，轉(zhuǎn)染CXCR4的細(xì)胞可以順SDF-1濃度而梯度遷移運(yùn)動(dòng)，細(xì)胞的活力也得到增加。通過(guò)基因工程將氣管上皮細(xì)胞轉(zhuǎn)染趨化因子SDF-