骨髓間質(zhì)干細(xì)胞移植抑制心肌梗死大鼠心肌間質(zhì)纖維化的作用研究.pdf

1、心肌梗死(myocardial infarction，MI)是嚴(yán)重威脅人類健康和生命的常見(jiàn)病之一。在心肌梗死急性期，梗死區(qū)心肌呈凝固性壞死，心肌間質(zhì)充血、水腫，伴多量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)。急性期過(guò)后，壞死的心肌逐漸被纖維組織替代，而非壞死區(qū)心肌間質(zhì)也因神經(jīng)內(nèi)分泌的影響發(fā)生重構(gòu)致使心臟的收縮和舒張功能受損并最終導(dǎo)致心力衰竭。 心肌梗死后期出現(xiàn)心室重構(gòu)的主要原因是心肌纖維化的形成。由于機(jī)械應(yīng)力作用、缺血性刺激、反應(yīng)性活性氧的作用及自我放大途

2、徑導(dǎo)致了心肌梗死后TNF-α，TGF-β及IL-6等炎癥因子大量生成。而大量的炎癥因子又通過(guò)刺激原位成纖維細(xì)胞的增殖，使得心肌間質(zhì)組織成纖維細(xì)胞數(shù)量大量擴(kuò)增，大量Ⅰ、Ⅲ型膠原合成并沉積于心肌間質(zhì)組織，導(dǎo)致心肌間質(zhì)纖維化，心室擴(kuò)張，致使心臟的收縮和舒張功能受損，最終導(dǎo)致遠(yuǎn)期心力衰竭，患者的生活質(zhì)量下降、勞動(dòng)力喪失，甚至危及生命。 及時(shí)有效的藥物或介入治療可顯著降低急性心肌梗死病死率。然而，無(wú)論是藥物溶栓治療還是介入再通治療，均只能

3、改善梗死區(qū)心肌血供，卻無(wú)法逆轉(zhuǎn)已經(jīng)壞死的心肌細(xì)胞，難以抑制心肌梗死后的炎癥反應(yīng)及心肌纖維化進(jìn)展。骨髓來(lái)源間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow derived meserlchymal stem cells，BMSCs)具有良好的增殖及多向分化潛能，且具有一定的抗炎癥和抗組織纖維化作用。大量的研究報(bào)道指出BMSCs移植治療心肌梗死模型動(dòng)物可以通過(guò)橫向分化或細(xì)胞融合的方式起到一定的治療效果。然而，BMSCs在梗死心肌局部分化為成熟心肌細(xì)胞效

4、率非常低，且分化后的心肌細(xì)胞是否具有功能還需進(jìn)一步證實(shí)。已有報(bào)道指出BMSCs能抑制肺、腎、肝等器官組織纖維化及炎癥反應(yīng)。因此，雖然BMSCs在心肌梗死局部分化心肌細(xì)胞能力有限而限制了其替代治療作用，但如果能有效抑制心肌梗死后期心臟間質(zhì)纖維化，則可有效延緩心肌梗死后期的病變，并能在一定程度上改善患者的愈后生活質(zhì)量。 為了解BMSCs是否具有抑制心肌梗死后期心臟間質(zhì)纖維化的作用。本研究通過(guò)體外分離擴(kuò)增大鼠BMSCs，并進(jìn)行成脂成骨

5、誘導(dǎo)分化，確定其多向分化潛能；同時(shí)制作SD大鼠心肌梗死模型，并于模型制作后24小時(shí)經(jīng)尾靜脈移植同種異體BMSCs，觀察細(xì)胞移植后心梗模型鼠的心功能，檢測(cè)模型鼠心肌TGF-β、FNF-α mRNA表達(dá)水平和Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)情況，并分別與未治療組模型鼠進(jìn)行比較，為今后的臨床治療試驗(yàn)提供試驗(yàn)依據(jù)。 1材料和方法： 1.1試驗(yàn)材料1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分3組：正常對(duì)照組、模型對(duì)照組、BMSCs治療組。模型對(duì)照組和BMSCs治

6、療組大鼠于MI后24小時(shí)分別給予生理鹽水和BMSCs細(xì)胞懸液治療，并于治療后3天、7天、21天處死。沿心臟縱軸切開(kāi)心臟標(biāo)本，部分組織用于提取RNA，另一部分組織用于石蠟包埋和切片。 1.1.2試驗(yàn)試劑與器材(略)1.2試驗(yàn)方法1.2.1大鼠BMSCs分離、培養(yǎng)、鑒定采用差速貼壁法分離、擴(kuò)增及純化SD鼠BMSCs并進(jìn)行表面抗原檢測(cè)和成脂、成骨分化能力鑒定。取P5～8代BMSCs用于后續(xù)試驗(yàn)。 1.2.2 SD大鼠心肌梗死模

7、型制作10％水合氯醛全麻SD大鼠，氣管插管，連接動(dòng)物呼吸機(jī)，調(diào)整潮氣量，連接BL-420生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)記錄大鼠心電圖變化。備皮。在心尖波動(dòng)最明顯處上一肋間開(kāi)胸，暴露心臟，撕開(kāi)心包。用7／0眼科帶線縫合針結(jié)扎左冠狀動(dòng)脈前降支。術(shù)后肌肉注射青霉素G鈉20萬(wàn)U／只，連續(xù)3天，預(yù)防手術(shù)感染。 1.2.3 BMSCs移植心肌梗死模型鼠SD大鼠心肌梗死模型制作后24小時(shí)經(jīng)尾靜脈注射1×106個(gè)／mlP5～8代BMSCs細(xì)胞懸液給BMSCs

8、治療組大鼠，1ml／只。 1.2.4超聲心動(dòng)圖檢測(cè)各組大鼠在處死前運(yùn)用二維超聲機(jī)檢測(cè)大鼠心臟功能。左心長(zhǎng)軸斷面測(cè)量LVDs、LVDd、IVSs、IVSd、LVPWs、LVPWd、EF等參數(shù)。心尖四腔心斷面測(cè)量E／A值。 1.2.4TGF-β1、TNF-α mRNA表達(dá)水平檢測(cè)取心梗模型鼠梗死區(qū)及梗死周圍約5-8mm區(qū)域內(nèi)心臟組織，Trizol提取組織總RNA。紫外分光光度計(jì)測(cè)A260、A280及OD值。RT-PCR檢測(cè)Ⅰ

9、、Ⅲ膠原、TNF-α、TGF-β 1mRNA表達(dá)水平。 1.2.5 Ⅰ、Ⅲ型膠原表達(dá)情況檢測(cè)石蠟包埋各組大鼠心臟組織標(biāo)本。切片，HE染色。免疫組化采用SABC法，一抗稀釋度為1：800，4℃孵育過(guò)夜，DAB顯色。PBS代替一抗做陰性對(duì)照。 1.2.6統(tǒng)計(jì)學(xué)分析所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件進(jìn)行t檢驗(yàn)和單因素方差分析，顯著性檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。 2 結(jié)果： 2.1大鼠BMSCs分離、培養(yǎng)、鑒定以差速貼

10、壁法分離培養(yǎng)的原代BMSCs，其貼壁細(xì)胞多呈梭形或成纖維狀。3代以上的BMSCs趨于純化，多數(shù)呈均一典型的“紡錘狀”成纖維樣細(xì)胞形態(tài)，細(xì)胞間排列呈旋渦狀。經(jīng)FCM檢測(cè)，BMSCs表達(dá)CD29和CD44分子，而不表達(dá)CD11b和CD45分子。體外能夠誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞和脂肪細(xì)胞分化，表明具有多項(xiàng)分化潛能。 2.2 SD大鼠心肌梗死模型結(jié)扎SD大鼠左冠狀動(dòng)脈前降支后，左室前壁立刻由鮮紅色變?yōu)榘导t色，搏動(dòng)減弱。手術(shù)后24小時(shí)心電圖檢測(cè)出

11、現(xiàn)病理性Q波，提示大鼠心肌梗死模型制作成功。 2.3經(jīng)尾靜脈移植BMSCs經(jīng)尾靜脈移植BMSCs前靜脈回抽見(jiàn)有紅色血液，注射BMSCs過(guò)程順利，沒(méi)有阻擋感。注射結(jié)束后，局部組織未見(jiàn)腫脹及出血。 2.4大鼠心功能模型對(duì)照組大鼠左室舒張末期及收縮末期內(nèi)徑逐漸擴(kuò)大，左室進(jìn)行性擴(kuò)張，左室收縮功能下降明顯，射學(xué)分?jǐn)?shù)與正常對(duì)照組相比差異明顯。BMSCs治療組大鼠左室舒張末期及收縮末期內(nèi)徑雖逐步擴(kuò)大，但與模型對(duì)照組相比心室擴(kuò)張受到明顯

12、遏制，射血分?jǐn)?shù)與正常對(duì)照組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，左室收縮功能與模型對(duì)照組相比明顯改善。 2.5大鼠心肌TGF-β1、TNF-α mRNA表達(dá)水平BMSCs治療組大鼠TGF-β、TNF-α DNA電泳條帶灰度變化呈現(xiàn)出與模型對(duì)照組相同的規(guī)律，但BMSCs治療組電泳條帶灰度明顯減弱。TGF-β1、TNF-α mRNA表達(dá)水平低于模型對(duì)照組。 2.5大鼠心?、瘛ⅱ笮湍z原表達(dá)情況BMSCs治療組大鼠心肌Ⅰ、Ⅲ型膠原沉積呈網(wǎng)絡(luò)狀，

13、與模型對(duì)照組相比纖維束纖細(xì)，纖維網(wǎng)絡(luò)稀疏，未見(jiàn)粗大纖維束連接成片。 3 結(jié)論： 3.1 體外培養(yǎng)的大鼠BMSCs具有良好的增殖能力，表達(dá)干細(xì)胞表面標(biāo)志物，且具有成脂、成骨多向分化潛能。 3.2同種異體BMSCs尾靜脈移植治療心肌梗死模型大鼠后可改善大鼠左心室心功能。 3.3同種異體BMSCs尾靜脈移植治療心肌梗死模型大鼠后可降低模型鼠心肌TGF-β1、TNF-α mRNA表達(dá)水平。 3.4同種異體