小鼠CXCR3A及人CXCR3B基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建、鑒定及生物學(xué)功能研究.pdf

1、CXC Chemokine Receptor3——CXCR3(CD183)是一種七次跨膜的G-蛋白偶聯(lián)受體,目前已發(fā)現(xiàn)三種剪接變體,分別為CXCR3-A(即通常所說(shuō)的CXCR3)、CXCR3-B及CXCR-3alt。CXCR3A主要表達(dá)于活化／記憶T細(xì)胞、NK細(xì)胞及巨噬細(xì)胞,其配體為CXCL9／Mig、CXCL10／IP-10及CXCL11／I-TAC。近年研究發(fā)現(xiàn),CXCR3A在一些惡性腫瘤細(xì)胞表面高表達(dá),通過(guò)受體-配體相互作用介導(dǎo)腫

2、瘤的轉(zhuǎn)移和侵襲。CXCR3B主要表達(dá)于內(nèi)皮細(xì)胞,除了可與CXCL9／Mig、CXCL10／IP-10及CXCL11／I-TAC結(jié)合,其還是CXCL4／PF4的功能性受體。配體與血管內(nèi)皮細(xì)胞表面的CXCR3B結(jié)合可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡,在維持血管穩(wěn)定方面具有重要作用。本研究旨在克隆小鼠CXCR3A基因并將其轉(zhuǎn)入不表達(dá)該分子的小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16中,在體內(nèi)外研究B16-mCXCR3A細(xì)胞的遷移能力和致瘤性。同時(shí)克隆人CXCR3B基因,并建立穩(wěn)定表

3、達(dá)人CXCR3B分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929-huCXCR3B,為制備相應(yīng)的單克隆抗體奠定了物質(zhì)基礎(chǔ)。
　　 第一部分小鼠CXCR3A基因的克隆及基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株B16-mCXCR3A的構(gòu)建
　　 目的：克隆小鼠CXCR3A基因并構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)該分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株B16-mCXCR3A。
　　 方法：采用PCR方法從pMD19-T／mCXCR3A質(zhì)粒中擴(kuò)增小鼠CXCR3A基因,插入到真核表達(dá)載體pIRES2-EGF

4、P中,脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染小鼠黑色素瘤細(xì)胞B16；G418加壓篩選陽(yáng)性克隆,分別用RT-PCR方法與免疫熒光技術(shù)分析陽(yáng)性克隆中CXCR3A在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。
　　 結(jié)果：構(gòu)建了表達(dá)小鼠CXCR3A基因的真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP／mCXCR3A,轉(zhuǎn)染該載體后獲得了穩(wěn)定表達(dá)小鼠CXCR3A的B16-mCXCR3A細(xì)胞。
　　 結(jié)論：構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)小鼠CXCR3A基因的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株B16-mCXCR3A,此為進(jìn)一

5、步體內(nèi)外研究奠定了基礎(chǔ)。
　　 第二部分B16-mCXCR3A細(xì)胞體外遷移及體內(nèi)對(duì)腫瘤形成與轉(zhuǎn)移的影響
　　 目的：用已構(gòu)建的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株B16-mCXCR3A研究小鼠CXCR3A分子在腫瘤形成及轉(zhuǎn)移過(guò)程中的作用。
　　 方法：采用Transwell系統(tǒng)檢測(cè)B16-mCXCR3A細(xì)胞在其配體IP-10介導(dǎo)下的遷移能力。將B16-mCXCR3A細(xì)胞分別通過(guò)皮下和眼靜脈注射接種于BALB／c小鼠,觀察在小鼠體內(nèi)的成

6、瘤率及腫瘤轉(zhuǎn)移情況。
　　 結(jié)果：在20μg／L小鼠IP-10的作用下,B16-mCXCR3A細(xì)胞(1×105個(gè))遷移的細(xì)胞數(shù)為3208個(gè),與B16組和B16-mock組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。于小鼠皮下接種B16-mCXCR3A細(xì)胞、B16細(xì)胞和B16-mock細(xì)胞,第20天成瘤率均為100％。于小鼠眼靜脈注射B16-mCXCR3A細(xì)胞,第21天時(shí)50％的小鼠在肺部出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的黑色腫瘤轉(zhuǎn)移灶,B16細(xì)胞組和B1

7、6-mock細(xì)胞組肺部未見(jiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移灶,B16-mCXCR3A組與B16組和B16-mock組相比均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)。
　　 結(jié)論：轉(zhuǎn)染小鼠CXCR3A基因的B16-mCXCR3A細(xì)胞,在小鼠IP-10介導(dǎo)下可定向遷移,并可促進(jìn)腫瘤的轉(zhuǎn)移。
　　 第三部分人CXCR3B基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的構(gòu)建、鑒定及生物學(xué)功能初步研究
　　 目的：克隆人CXCR3B基因,并構(gòu)建含有該目的基因的真核表達(dá)載體,獲得穩(wěn)定表達(dá)人

8、CXCR3B分子的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929-huCXCR3B。
　　 方法：采用PCR方法從pMD19-T／huCXCR3A質(zhì)粒中擴(kuò)增人CXCR3B基因,通過(guò)雙酶切裝入到真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP中；脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染L929細(xì)胞,G418加壓篩選陽(yáng)性克??；分別用RT-PCR方法與免疫熒光技術(shù)分析陽(yáng)性克隆中人CXCR3B在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。MTT分析基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929-huCXCR3B在其配體Mig作用下的增殖能力。

9、
　　 結(jié)果：成功克隆了人CXCR3B基因并構(gòu)建了表達(dá)該分子的真核表達(dá)載體pIRES2-EGFP／huCXCR3B,并獲得了穩(wěn)定表達(dá)人CXCR3B的L929-huCXCR3B細(xì)胞,膜表面人CXCR3B分子的陽(yáng)性表達(dá)率為93％。該基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞與Mig共培養(yǎng)24、48及72h,抑制率分別為41.44％、44.01％和24.80％。
　　 結(jié)論：構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)人CXCR3B基因的基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株L929-huCXCR3BB,此為