人類白細胞抗原-G siRNA真核表達載體的構建及穩(wěn)定轉染JEG-3細胞株的建立.pdf

1、人類白細胞抗原-G(humanleukocyteantigen-G，HLA-G)屬于非經(jīng)典人類白細胞抗原Ⅰ類分子，主要有3個特點：選擇性組織分布；有限的分子多態(tài)性；mRNA選擇性剪接形成不同的異構體分子，分別編碼不同的蛋白質分子亞型。近年來發(fā)現(xiàn)，HLA-G蛋白通過多種途徑參與維持正常妊娠，如HLA-G陽性的細胞通過與妊娠期子宮蛻膜內(nèi)自然殺傷細胞(uNK)、細胞毒性T細胞(CTL)等細胞表面抑制性受體(killercellinhibito

2、ryreceptor，KIR)相互作用而抑制細胞毒作用；調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞因子釋放向Th2細胞因子極向轉化的過程；提高胚胎的卵裂速率等。HLA-G基因表達異常，會引起不孕，習慣性流產(chǎn)，先兆子癇等病理性妊娠。因此，HLA-G是人類生殖中的重要調(diào)控蛋白，研究HLA-G在妊娠中的作用在人類生殖生物學和生殖免疫學具有重要的理論意義，對于人類輔助生殖技術具有潛在的應用價值。 RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是一種

3、廣泛存在于生物體內(nèi)的由雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsRNA)介導的、序列特異的同源基因轉錄后基因沉寂(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)現(xiàn)象。一般認為，RNAi的作用機制是含有19-23個核苷酸對的小RNA片段，即小干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)作為中介分子，與Dicer和其他一些蛋白質共同構成RNA誘導的沉寂復合物(RNAinduci

4、ngsuppresscomplex，RISC)，依靠堿基互補規(guī)律識別與siRNA同源的目的mRNA分子，并將其降解。目前RNAi作為一種新的基因反向遺傳研究的工具，具有高效、特異地抑制基因表達的特點，已廣泛應用于基因功能和基因治療等研究中。因此，采用RNA干擾技術研究HLA-G在人類生殖中的生物學和免疫學功能具有良好的前景。 目的：1.篩選出能夠特異降調(diào)節(jié)JEG-3細胞中HLA-G表達的siRNA序列；2.構建針對HLA-G的s

5、iRNA真核表達質粒載體；3.建立HLA-G穩(wěn)定降調(diào)節(jié)的人絨癌JEG-3細胞株。 方法：1.依據(jù)siRNA設計原則，結合HLA-G基因的序列特征，借助生物信息軟件在線設計了兩對靶向HLA-G的siRNA，由公司化學合成。應用脂質體轉染的方法分別將其轉染JEG-3細胞，48小時后通過流式細胞術、RT-PCR及Western-blot等方法分別檢測兩對siRNA對JEG-3細胞中HLA-GmRNA和蛋白水平表達的影響；2.應用基因重

6、組技術，將實驗一篩選出的寡核苷酸序列插入質粒pSilencer2.1-U6-neo，構建HLA-GsiRNA真核表達質粒載體pSilencer2.1-U6-neo-HLA-G(簡稱pSil-HLA-G)及陰性對照pSilencer2.1-U6-neo-ns(簡稱pSil-ns)，用限制性酶切質粒和序列測定對其進行鑒定。3.應用脂質體分別將質粒pSil-HLA-GpSilencer2.1-U6-neo空載體、pSil-ns轉染JEG-3細

7、胞，應用RT-PCR、Western-blot等方法鑒定轉染前后各組JEG-3細胞中HLA-GmRNA及蛋白表達水平有無變化。經(jīng)過G418抗性篩選，獲得穩(wěn)定轉染細胞系。 結果：1.經(jīng)過流式細胞術(flowcytometry，F(xiàn)CM)、RT-PCR和Western-blot等方法檢測，轉染HLA-GsiRNA后的JEG-3細胞中HLA-G的表達明顯下降，成功篩選出有效特異抑制HLA-G表達的siRNA基因序列；2.限制性酶切重組質

8、粒及測序結果證實：正確的把目的片段插入質粒pSilencer2.1-U6-neo，成功地構建了HLA-G基因siRNA的真核表達質粒載體pSil-HLA-G；3.轉染后的細胞能夠抵抗G418的壓力，HLA-G的表達明顯下調(diào)，成功的建立了能夠穩(wěn)定降調(diào)節(jié)HLA-G基因表達的JEG-3細胞株。 結論：本實驗利用RNAi技術，成功地篩選出能夠特異抑制HLA-G基因表達的siRNA基因序列；成功構建了pSil-HLA-G重組質粒；建立了穩(wěn)