人類白細胞抗原-G siRNA真核表達載體的構(gòu)建及穩(wěn)定轉(zhuǎn)染JEG-3細胞株的建立.pdf

1、人類白細胞抗原-G(humanleukocyteantigen-G，HLA-G)屬于非經(jīng)典人類白細胞抗原Ⅰ類分子，主要有3個特點：選擇性組織分布；有限的分子多態(tài)性；mRNA選擇性剪接形成不同的異構(gòu)體分子，分別編碼不同的蛋白質(zhì)分子亞型。近年來發(fā)現(xiàn)，HLA-G蛋白通過多種途徑參與維持正常妊娠，如HLA-G陽性的細胞通過與妊娠期子宮蛻膜內(nèi)自然殺傷細胞(uNK)、細胞毒性T細胞(CTL)等細胞表面抑制性受體(killercellinhibito

2、ryreceptor，KIR)相互作用而抑制細胞毒作用；調(diào)節(jié)Th1/Th2細胞因子釋放向Th2細胞因子極向轉(zhuǎn)化的過程；提高胚胎的卵裂速率等。HLA-G基因表達異常，會引起不孕，習(xí)慣性流產(chǎn)，先兆子癇等病理性妊娠。因此，HLA-G是人類生殖中的重要調(diào)控蛋白，研究HLA-G在妊娠中的作用在人類生殖生物學(xué)和生殖免疫學(xué)具有重要的理論意義，對于人類輔助生殖技術(shù)具有潛在的應(yīng)用價值。 RNA干擾(RNAinterference，RNAi)是一種

3、廣泛存在于生物體內(nèi)的由雙鏈RNA(double-strandedRNA,dsRNA)介導(dǎo)的、序列特異的同源基因轉(zhuǎn)錄后基因沉寂(post-transcriptionalgenesilencing，PTGS)現(xiàn)象。一般認為，RNAi的作用機制是含有19-23個核苷酸對的小RNA片段，即小干擾RNA(smallinterferingRNA,siRNA)作為中介分子，與Dicer和其他一些蛋白質(zhì)共同構(gòu)成RNA誘導(dǎo)的沉寂復(fù)合物(RNAinduci

4、ngsuppresscomplex，RISC)，依靠堿基互補規(guī)律識別與siRNA同源的目的mRNA分子，并將其降解。目前RNAi作為一種新的基因反向遺傳研究的工具，具有高效、特異地抑制基因表達的特點，已廣泛應(yīng)用于基因功能和基因治療等研究中。因此，采用RNA干擾技術(shù)研究HLA-G在人類生殖中的生物學(xué)和免疫學(xué)功能具有良好的前景。 目的：1.篩選出能夠特異降調(diào)節(jié)JEG-3細胞中HLA-G表達的siRNA序列；2.構(gòu)建針對HLA-G的s

5、iRNA真核表達質(zhì)粒載體；3.建立HLA-G穩(wěn)定降調(diào)節(jié)的人絨癌JEG-3細胞株。 方法：1.依據(jù)siRNA設(shè)計原則，結(jié)合HLA-G基因的序列特征，借助生物信息軟件在線設(shè)計了兩對靶向HLA-G的siRNA，由公司化學(xué)合成。應(yīng)用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法分別將其轉(zhuǎn)染JEG-3細胞，48小時后通過流式細胞術(shù)、RT-PCR及Western-blot等方法分別檢測兩對siRNA對JEG-3細胞中HLA-GmRNA和蛋白水平表達的影響；2.應(yīng)用基因重

6、組技術(shù)，將實驗一篩選出的寡核苷酸序列插入質(zhì)粒pSilencer2.1-U6-neo，構(gòu)建HLA-GsiRNA真核表達質(zhì)粒載體pSilencer2.1-U6-neo-HLA-G(簡稱pSil-HLA-G)及陰性對照pSilencer2.1-U6-neo-ns(簡稱pSil-ns)，用限制性酶切質(zhì)粒和序列測定對其進行鑒定。3.應(yīng)用脂質(zhì)體分別將質(zhì)粒pSil-HLA-GpSilencer2.1-U6-neo空載體、pSil-ns轉(zhuǎn)染JEG-3細

7、胞，應(yīng)用RT-PCR、Western-blot等方法鑒定轉(zhuǎn)染前后各組JEG-3細胞中HLA-GmRNA及蛋白表達水平有無變化。經(jīng)過G418抗性篩選，獲得穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細胞系。 結(jié)果：1.經(jīng)過流式細胞術(shù)(flowcytometry，F(xiàn)CM)、RT-PCR和Western-blot等方法檢測，轉(zhuǎn)染HLA-GsiRNA后的JEG-3細胞中HLA-G的表達明顯下降，成功篩選出有效特異抑制HLA-G表達的siRNA基因序列；2.限制性酶切重組質(zhì)

8、粒及測序結(jié)果證實：正確的把目的片段插入質(zhì)粒pSilencer2.1-U6-neo，成功地構(gòu)建了HLA-G基因siRNA的真核表達質(zhì)粒載體pSil-HLA-G；3.轉(zhuǎn)染后的細胞能夠抵抗G418的壓力，HLA-G的表達明顯下調(diào)，成功的建立了能夠穩(wěn)定降調(diào)節(jié)HLA-G基因表達的JEG-3細胞株。 結(jié)論：本實驗利用RNAi技術(shù)，成功地篩選出能夠特異抑制HLA-G基因表達的siRNA基因序列；成功構(gòu)建了pSil-HLA-G重組質(zhì)粒；建立了穩(wěn)