穩(wěn)定表達(dá)ST3GALⅠ基因的R-MDCK細(xì)胞株的建立.pdf

1、細(xì)胞膜表面含糖鏈的唾液酸(Sialic acid，SA)是流感病毒的受體。唾液酸屬于九碳糖分子家族，是構(gòu)成細(xì)胞表面糖綴合物的組成成分，通常位于細(xì)胞表面糖蛋白、糖脂分子或其他多糖中糖鏈的最外側(cè)加帽位置，攜帶負(fù)電荷，對于細(xì)胞與細(xì)胞之間的識別及細(xì)胞和細(xì)胞外基質(zhì)的相互作用有重要影響。唾液酸是通過其第二位碳原子以α-2，3或α-2，6糖苷鍵連接于糖鏈末端的半乳糖基或己糖上，半乳糖Galactoside簡稱為Gal。這種不同的連接形式是在唾液酸糖基

2、轉(zhuǎn)移酶的催化作用下完成的。介導(dǎo)唾液酸以α-2，6糖苷鍵連接到半乳糖上的是ST6Gal轉(zhuǎn)移酶，介導(dǎo)唾液酸以α-2，3糖苷鍵連接到半乳糖上的是ST3Gal轉(zhuǎn)移酶。
　　研究發(fā)現(xiàn)，哺乳動物細(xì)胞既表達(dá)SAα2，3Gal，又表達(dá)SAα2，6Gal。禽流感病毒通過其表面的血凝素（HA）與宿主細(xì)胞表面的唾液酸寡糖受體相結(jié)合侵染宿主細(xì)胞，大多數(shù)禽流感病毒傾向于識別SAα2，3Gal受體，而人流感病毒則傾向于識別SAα2，6Gal的受體，豬流感病毒

3、則對兩者皆有結(jié)合能力。但哺乳動物細(xì)胞膜上唾液酸α-2，3-半乳糖受體豐度偏低，導(dǎo)致低致病性禽流感病毒在這種細(xì)胞中的培養(yǎng)滴度低，嚴(yán)重影響了傳代細(xì)胞代替雞胚生產(chǎn)低致病性禽流感病毒疫苗工業(yè)的進(jìn)程。國外學(xué)者已將人流感受體組分2，6連接基因ST6GALⅠ整合進(jìn)MDCK細(xì)胞構(gòu)建成穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系，用以研究人流感病毒對2，6連接性受體的親和能力。國內(nèi)的步志高等也構(gòu)建了適合高致病性禽流感病毒生長的重組MDCK細(xì)胞，而低致病性的禽流感病毒的收獲滴度卻較低，

4、所以篩選能有效提升低致病性禽流感病毒培養(yǎng)滴度的穩(wěn)定表達(dá)雞ST3GALⅠ基因的MDCK細(xì)胞株尤為重要。
　　鑒與此，本研究對雞ST3GAL轉(zhuǎn)移酶基因進(jìn)行了優(yōu)化，方法是克隆雞ST3GALⅠ基因并將其插入真核表達(dá)質(zhì)粒pIRES中，構(gòu)建重組質(zhì)粒pIRES-ST3GALⅠ，通過PCR擴增，限制性酶切和DNA序列分析鑒定目的基因插入大小及方向正確，成功構(gòu)建了pIRES-ST3GALⅠ真核表達(dá)載體。利用真核表達(dá)載體pIRES和重組的表達(dá)載體分別

5、轉(zhuǎn)化入大腸桿菌DH5α中用不同濃度的IPTG誘導(dǎo)后，發(fā)現(xiàn)不同濃度的IPTG誘導(dǎo)的目的蛋白產(chǎn)量之間沒有明顯的差異，低至0.2~1.2 mmol/L IPTG也可誘導(dǎo)大量目的蛋白產(chǎn)生。SDS-PAGE顯示目的蛋白得到了表達(dá)。鑒定正確的真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞，用G418抗性篩選穩(wěn)定表達(dá)的重組細(xì)胞R-MDCK。PCR及RT-PCR技術(shù)鑒定表達(dá)陽性的單克隆細(xì)胞株。將不同H9亞型禽流感病毒毒株按相同滴度接種R-MDCK細(xì)胞和對照組MDCK細(xì)胞