多基因共穩(wěn)定表達(dá)篩選載體與siat7e穩(wěn)轉(zhuǎn)MDCK細(xì)胞株的構(gòu)建.pdf

1、科學(xué)研究中構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株，抗體工程和細(xì)胞工程領(lǐng)域篩選種子細(xì)胞經(jīng)常需要兩個(gè)或以上的基因穩(wěn)定共表達(dá)。通常通過兩個(gè)載體共轉(zhuǎn)染的篩選方法來實(shí)現(xiàn)，然而實(shí)踐中常面對(duì)許多問題。因此，有必要開發(fā)單個(gè)載體實(shí)現(xiàn)多基因共同表達(dá)。MDCK細(xì)胞作為流感病毒疫苗生產(chǎn)的重要細(xì)胞系之一，廣泛應(yīng)用于多種病毒的擴(kuò)增與純化。但是MDCK細(xì)胞貼壁依賴性強(qiáng)，需要表面粘附來進(jìn)行增殖。因此實(shí)現(xiàn)MDCK細(xì)胞于懸浮培養(yǎng)中增殖，將簡(jiǎn)化病毒生產(chǎn)過程，并極大地促進(jìn)流感病毒的生產(chǎn)規(guī)模。

2、r>　　本文對(duì)多基因共穩(wěn)定表達(dá)篩選載體與siat7e穩(wěn)轉(zhuǎn)MDCK細(xì)胞株的構(gòu)建進(jìn)行了研究。本研究分為兩個(gè)部分：
　　第一部分：IRES序列的多基因共穩(wěn)定表達(dá)篩選載體構(gòu)建。
　　目的：構(gòu)建一個(gè)IRES序列介導(dǎo)的多基因共表達(dá)載體，實(shí)現(xiàn)兩個(gè)目的基因和篩選標(biāo)記基因共用一個(gè)啟動(dòng)子高效表達(dá)，提高多基因穩(wěn)定共表達(dá)細(xì)胞株的篩選效率。
　　方法：以實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的載體pLV-MCS-Puro為骨架，設(shè)計(jì)并全基因合成雙基因克隆表達(dá)元件，連接

3、到骨架載體，構(gòu)建多基因共表達(dá)載體pLV-2MCS-Puro，以DsRed2和EGFP熒光蛋白基因驗(yàn)證該載體用于多基因穩(wěn)定共表達(dá)細(xì)胞株篩選的效率。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建了pLV-2MCS-Puro載體以及DsRed2和EGFP共表達(dá)重組質(zhì)粒pLV-DsRed2-EGFP-Puro。瞬時(shí)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)證明該載體能介導(dǎo)多基因共表達(dá)。抗性篩選獲得了MDCK和Hela兩種細(xì)胞的多基因穩(wěn)定共表達(dá)細(xì)胞池。細(xì)胞池涂片熒光顯微鏡觀察和計(jì)數(shù)表明抗性細(xì)胞池Ds

4、Red2和EGFP雙陽率接近100％。基因組和轉(zhuǎn)錄水平PCR及蛋白免疫印跡實(shí)驗(yàn)表明DsRed2和EGFP穩(wěn)定整合到抗性細(xì)胞基因組并且兩種蛋白表達(dá)水平較為一致。
　　結(jié)論：成功構(gòu)建了多基因共表達(dá)載體pLV-2MCS-Puro，實(shí)現(xiàn)了兩個(gè)目的基因和抗性基因串聯(lián)共表達(dá)，并且具有高效的多基因穩(wěn)定共表達(dá)細(xì)胞株篩選效率。該載體在研究蛋白相互作用以及工程細(xì)胞構(gòu)建等方面具有一定的應(yīng)用前景。
　　第二部分：siat7e基因穩(wěn)定表達(dá)的MDCK細(xì)

5、胞株的構(gòu)建。
　　目的：構(gòu)建表達(dá)siat7e的MDCK細(xì)胞株，用以解決MDCK細(xì)胞的懸浮培養(yǎng)問題。
　　方法：利用PCR技術(shù)，從MDCK細(xì)胞基因組中擴(kuò)增出全長(zhǎng)1011 bp的siat7e基因，并將該基因分別克隆到pBflag、pLV-MCS-Puro和pSF-EGFP表達(dá)載體中，三種真核表達(dá)載體轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞后，篩選siat7e基因穩(wěn)定表達(dá)的MDCK細(xì)胞株，以期實(shí)現(xiàn)MDCK細(xì)胞適應(yīng)無血清懸浮培養(yǎng)。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建

6、了pBflag-siat7e、pLV-siat7e-Puro、pSF-EGFP-siat7e三種表達(dá)質(zhì)粒。pBflag-siat7e重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞，抗性篩選獲得四個(gè)克隆，蛋白質(zhì)印記和基因組PCR未見siat7e目的條帶，推測(cè)可能未篩選到siat7e陽性克隆，且細(xì)胞未見明顯表型。pLV-siat7e-Puro重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染MDCK細(xì)胞，抗性篩選獲得MDCK耐藥細(xì)胞池?；蚪M和轉(zhuǎn)錄水平PCR都證明目的基因siat7e穩(wěn)定整合到MDC

7、K細(xì)胞基因組。同樣細(xì)胞未見明顯表型，降低血清或者無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)耐藥性MDCK細(xì)胞，未獲得適應(yīng)懸浮培養(yǎng)的MDCK細(xì)胞系。利用pSF-EGFP-siat7e重組載體，融合表達(dá)EGFP和siat7e蛋白，熒光定位siat7e蛋白。熒光倒置顯微鏡下觀察EGFP熒光蛋白表達(dá)情況，驗(yàn)證siat7e基因成功轉(zhuǎn)染至MDCK細(xì)胞?；蚪M和轉(zhuǎn)錄水平PCR驗(yàn)證，證明siat7e基因穩(wěn)定整合到MDCK細(xì)胞基因組。蛋白熒光定位驗(yàn)證siat7e表達(dá)的唾液酸轉(zhuǎn)移酶