乙腦病毒分離株P(guān)rM-E和E基因表達(dá)載體構(gòu)建及E基因表達(dá)的研究.pdf

1、乙型腦炎病毒又稱(chēng)日本腦炎病毒(Japaneseencephalitisvirus,JEV）屬于黃病毒科(Flaviridae)黃病毒屬，是一種由蚊蟲(chóng)傳播的急性病毒性傳染病，對(duì)人類(lèi)危害巨大。豬是JEV最重要的自然增殖動(dòng)物，是乙型腦炎的主要傳染源，能引起懷孕母豬發(fā)生流產(chǎn)、死胎、木乃伊胎，公豬發(fā)生睪丸炎。因此，探討研究JEV的防制對(duì)于人類(lèi)健康和養(yǎng)豬業(yè)具有重要的意義。
　　本試驗(yàn)通過(guò)收集某豬場(chǎng)一例發(fā)病種公豬的睪丸，處理后經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)和乳鼠腦

2、內(nèi)接毒等方法分離JEV，采用RT-PCR方法對(duì)所分離的病毒進(jìn)行鑒定，并將擴(kuò)增的PrM/E基因測(cè)序結(jié)果與GenBank上強(qiáng)毒株JEVSA14(U14163)和弱毒株SA14-14-2(AF315119)基因序列進(jìn)行比較，結(jié)果表明：乙型腦炎病毒貴州分離株的基因核酸序列與SA14和SA14-14-2的同源性分別為98.1％和97.1％，氨基酸序列同源性分別為99.3％和97.8％，毒力實(shí)驗(yàn)和序列分析均顯示分離病毒為乙腦病毒強(qiáng)毒株，遺傳進(jìn)化分析

3、表明分離株為基因Ⅲ型。對(duì)E蛋白的跨膜結(jié)構(gòu)，親水性、抗原指數(shù)、柔韌性、表面可及性和二級(jí)結(jié)構(gòu)分析結(jié)果表明：乙型腦炎病毒貴州分離株的E蛋白基因可能在肽鏈的第146～156、184～190、386～392位等氨基酸區(qū)域內(nèi)或附近存在優(yōu)勢(shì)的抗原表位。
　　通過(guò)設(shè)計(jì)2對(duì)引物，從分離毒株的細(xì)胞培養(yǎng)液中提取總RNA，采用RT-PCR實(shí)驗(yàn)技術(shù)，分別擴(kuò)增出PrM/E與E基因片段，并將其分別克隆至pMD19-T載體中，經(jīng)測(cè)序和酶切鑒定后，再將PrM/E和

4、E基因分別克隆于原核表達(dá)載體pET32a(+)和真核表達(dá)載體pcDNA3.1(+)中，成功構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)/PrM/E和pET32a(+)/E及真核表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1(+)/PrM/E和pcDNA3.1(+)/E。
　　將上述構(gòu)建的原核表達(dá)質(zhì)粒pET32a(+)/E轉(zhuǎn)入E.coliBL21(DE3)中，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)進(jìn)行表達(dá)，并通過(guò)Ni-IDA純化E蛋白，經(jīng)Western-Blotting分析E融合蛋白有良