豬乙型腦炎病毒RT-PCR檢測方法的建立及乙腦病毒四川分離株P(guān)rM-E基因的序列分析.pdf

1、乙型腦炎（簡稱乙腦）是一種經(jīng)蚊媒傳播的嚴(yán)重威脅人畜健康的急性傳染病。豬是乙腦病毒的重要儲(chǔ)存宿主和擴(kuò)增宿主，乙腦帶毒豬是該疫病的主要傳染源。該病給我國的養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。本研究建立了豬乙腦病毒RT-PCR診斷方法并對分離自四川崇州豬場和內(nèi)江豬場的蚊源乙腦病毒（CZ1株和NJ1株）進(jìn)行PrM/E基因的序列分析，從分子水平上了解四川乙腦分離毒株的生物學(xué)特性，對JEV的診斷、預(yù)防和控制具有較大的意義。
　　 1.豬乙型腦炎病毒

2、RT-PCR檢測方法的建立
　　 參考GenBank中收錄的31株JEV E基因序列，進(jìn)行相似性分析，以SA14-14-2為參照確定1725～2163區(qū)段為擴(kuò)增靶序列；用Primer5軟件合成了一對引物(P1/P2),產(chǎn)物長度為439bp。對試驗(yàn)的Mg2+濃度、引物濃度、退火溫度等反應(yīng)條件進(jìn)行優(yōu)化、選擇。確定了PT-PCR擴(kuò)增最佳體系為：10×buffer(Mg2+-Free)5μL,25mM Mg2+2.0μL,2.5mM d

3、NTP4μL,10pmol上下游引物各0.8μL,5U/μL Taq DNA聚合酶0.5μL, DNA模板1μL，最后用無菌去離子水補(bǔ)至50μL。PCR擴(kuò)增程序如下：94℃～5min;94℃～30S,56℃～30S,72℃40S,30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10min,4℃保存。RT-PCR特異性檢測試驗(yàn)表明，該方法對常見的豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合癥病毒、豬偽狂犬病毒、豬細(xì)小病毒擴(kuò)增均無條帶；敏感性檢測顯示，能最低檢測到10pg的JEV核酸

4、。結(jié)果表明建立了RT-PCR檢測JEV方法，具有簡單、快速、特異性好、靈敏性高等優(yōu)點(diǎn)。
　　 2.四川乙腦分離株CZ1株、NJ1株P(guān)rM/E基因的序列分析
　　 采用RT-PCR擴(kuò)增并克隆分離株的PrM/E區(qū)段序列，利用PrM（456～695位）區(qū)段序列與29株參考序列進(jìn)行基因分型分析，并對E區(qū)段核苷酸序列與減毒活疫苗株SA14-14-2的相應(yīng)序列進(jìn)行比對，分析CZ1株、NJ1株與SA14-14-2氨基酸的相似性及關(guān)鍵結(jié)

5、構(gòu)域的差異。
　　 結(jié)果表明，CZ1株P(guān)rM(456～695位)區(qū)基因分型證實(shí)分離株屬于基因Ⅰ型，E區(qū)段與SA14-14-2的核苷酸與氨基酸相似性分別為90.9％和97.2％，但在E蛋白的活性關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域有15個(gè)氨基酸存在差異；JEV-NJ1株P(guān)rM(456～695位)區(qū)基因分型證實(shí)分離株屬于基因Ⅲ型，E區(qū)段與SA14-14-2的核苷酸與氨基酸相似性分別為99.6％和99.2％，但在E蛋白的活性關(guān)鍵結(jié)構(gòu)域有3個(gè)氨基酸存在差異；本研