小反芻獸疫病毒疫苗株與4系野毒株RT-PCR鑒別方法的建立及巖羊分離株的基因序列分析.pdf

1、小反芻獸疫（Peste des Petits Ruminants, PPR）由副粘病毒科麻疹病毒屬的小反芻獸疫病毒(Peste des Petits Ruminants virus, PPRV)引起，以發(fā)熱，眼、鼻有大量漿性分泌物、潰瘍和壞死性口腔炎，胃炎，腹瀉和肺炎為特征的一種嚴重的烈性、接觸性傳染病。主要感染小反芻獸，特別是山羊和綿羊高度易感。PPR嚴重威脅著動物衛(wèi)生安全和畜牧業(yè)的發(fā)展，是需要采取嚴厲的強制預防，控制和撲滅的動物疫病

2、之一。2007年7月，我國西藏自治區(qū)阿里地區(qū)日土縣發(fā)生PPR疫情，這是我國首次發(fā)生PPR。疫情發(fā)生后，立即對疫區(qū)及周邊地區(qū)的綿羊、山羊接種小反芻獸疫Nigeria75/1疫苗進行預防免疫，但是弱毒株的存在可能會干擾PPR的血清學調查，導致無法與野毒感染進行區(qū)分。
　　 針對上述情況，本研究采用根據(jù)H基因的多變區(qū)域設計特異性引物H1a/H2b聯(lián)合OIE規(guī)定的基于N基因檢測PPRV的標準通用引物NP3/NP4，建立區(qū)分PPRV野毒株

3、與疫苗株的聯(lián)合RT-PCR方法。結果表明，針對N基因的RT-PCR方法能同時檢測PPRV野毒株與疫苗株;而針對H基因的RT-PCR方法只能檢測PPRV4系野毒株，不能檢測PPRV疫苗株。根據(jù)2次RT-PCR反應的結果，能夠很好的區(qū)分PPRV4系野毒株與疫苗株。而且可檢測到的最低模板量可達7.7×10-3 ng/μl，該值完全可以滿足作為診斷方法的要求?？傊摍z測方法可以成功的擴增出國內流行的毒株，專一性好，靈敏度高，準確度高，因此有潛力

4、用于獸醫(yī)臨床上小反芻獸疫病毒疫苗毒與野毒的鑒別診斷。
　　 根據(jù)Genbank中發(fā)表的PPRV基因序列，我們設計14對擴增引物、91條測序引物運用反轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)獲取了覆蓋巖羊分離株（簡稱Tibet/07-Y）全基因組的14個重疊片段。病毒RNA的5’及3’端的序列通過cDNA末端快速擴增技術(RACE)獲取。該Tibe/07-Y分離株全長為15948bp與已發(fā)表的PPRV毒株序列長度相同，全基因組編碼6種結

5、構蛋白，各個蛋白的基因起始、終止序列在進化上的保守性很高。與PPRV基因4系毒株PPRV/China/Tibet/Geg/07-30（簡稱Tibet07-30）、Turkey2000，基因2系毒株Nigeria75/1與Nigeria76/1，基因1系毒株C(o)te d' Ivoire89的核苷酸同源性分別為99.7％、92.6％、89.5％。
　　 對Tibet/07-Y的H基因進行分子生物學特征分析，發(fā)現(xiàn)H基因由1957個

6、核苷酸組成，編碼區(qū)有1830個核苷酸共編碼609個氨基酸，與其他PPRV分離株核苷酸和氨基酸序列同源性分別為88.6％-99.7％和89.3％-99.7％。與麻疹病毒屬的其他病毒的核苷酸和氨基酸同源性為46.2-54.8％和33.4-55.2％。H蛋白的疏水區(qū)高度保守，N末端錨定區(qū)由38-58個氨基酸組成。H蛋白含有13個半胱氨酸殘基、37個脯氨酸及四個潛在的N-糖基化位點，分別命名為N172 KSK175、N215 VSS218、N2