豬圓環(huán)病毒2型廣東毒株全基因的序列分析及分離新方法的建立.pdf

1、豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovums type 2，PCV2)不僅可以引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)，而且還與豬皮炎腎病綜合癥(Porcine dermatitis and nephropathysyndrome,PDNS)、增生性壞死性肺炎(Proliferative and necrotizing pneumonia,PNP)、豬呼吸道綜合征(porcine respiratory disease compl

2、ex,PRDC)、豬先天性震顫(congenitaltremors,CT)、繁殖障礙等疾病密切相關(guān)。自從1991年加拿大首次報(bào)道了PCV2是斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征(PMWS)的主要病原以來(lái)，PCV2病毒在世界各地迅速蔓延。2000年郎洪武首次報(bào)道檢測(cè)出PCV抗原，之后越來(lái)越多的報(bào)道證實(shí)PCV2病毒在我國(guó)的豬場(chǎng)中也有廣泛的感染，已給養(yǎng)豬業(yè)造成了相當(dāng)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。臨床上PCV2常與豬呼吸與繁殖障礙綜合征病毒(Porcine reprod

3、uctive and respiratory syndrome virus,PRRSV)、偽狂犬病毒(Pseudorabies virus,PRV)、豬細(xì)小病毒(porcineParvovirus,PPV)、豬圓環(huán)病毒1型(PCV1)、豬瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)等其它一些病原微生物混合感染，而PCV2、PCV1、CSFV、PPV等病毒在PK-15細(xì)胞上又不產(chǎn)生細(xì)胞病變，給PCV2病毒的分

4、離工作帶來(lái)一定的困難。2006年暴發(fā)的豬高熱疫情中，除了高致病性PRRSV，還發(fā)現(xiàn)PCV2、PPV、PRV及CSFV混合感染的病例。以往對(duì)于PCV2的分離，一般是通過(guò)PK-15細(xì)胞的傳代培養(yǎng)來(lái)達(dá)到凈化的目的，最后靠針對(duì)特定病毒的特異性檢測(cè)鑒定凈化的效果。而對(duì)于排除其他未知的病毒卻沒(méi)有好的方法。因此本研究在分離鑒定豬高致病性藍(lán)耳病病例中的PCV2病毒過(guò)程中，利用PCV2全基因組的感染性建立了一套行之有效的PCV2病毒分離方法。主要內(nèi)容及結(jié)

5、果如下: 1.根據(jù)GenBank中已發(fā)表的豬圓環(huán)病毒2型基因序列，選擇PCV2基因組上唯一的SAcⅡ位點(diǎn)設(shè)計(jì)一對(duì)引物，對(duì)29份從2007年5月到2007年11月期間廣東4個(gè)地區(qū)的豬場(chǎng)豬高致病性藍(lán)耳病病例的豬體淋巴結(jié)病料應(yīng)用PCR技術(shù)進(jìn)行了PCV2全基因組擴(kuò)增，并將4株陽(yáng)性基因克隆入pMD18-T載體，篩選出陽(yáng)性重組質(zhì)粒pMD-PCV2進(jìn)行測(cè)序，并將測(cè)序結(jié)果與國(guó)內(nèi)外已發(fā)表的參考毒株進(jìn)行序列比對(duì)分析。結(jié)果表明，分離到的4株P(guān)CV2全

6、基因大小相同，都為1767bp，分別命名為GDYFJ，GDSHJ，ODZQJ，GDBLJ。它們與國(guó)內(nèi)不同地區(qū)的分離株全基因組序列同源性差異較大，沒(méi)有明顯的規(guī)律。但與3株兩廣地區(qū)的毒株親緣關(guān)系較近，由此可見(jiàn)，這次新疫情中PCV2的變異較小，在引發(fā)疫情暴發(fā)的因素中更多的可能與PCV2引起感染豬的免疫抑制有關(guān)。 2.將構(gòu)建的陽(yáng)性質(zhì)粒pMD-PCV2大量制備，用SacⅡ切出PCV2全基因組，體外環(huán)化后轉(zhuǎn)染PK-15細(xì)胞，利用PCV2全基