豬Ⅱ型圓環(huán)病毒流行毒株全基因組的克隆與序列分析及核酸疫苗的初步研究.pdf

1、參考GenBank上發(fā)表的豬圓環(huán)病毒Ⅱ型(porcine circovirus 2，PCV2)全基因組序列，設(shè)計(jì)一對引物，通過反向PCR技術(shù)擴(kuò)增出廣西、湛江、海南等地9株P(guān)CV2流行株的全基因，并進(jìn)行了序列測定與分析，結(jié)果表明：9株P(guān)CV2的基因組全長為1 768bp或1 767bp，同源性比較發(fā)現(xiàn)，這9株P(guān)CV2核苷酸序列間同源性為95.6％～100％，與各國PCV2毒株的核苷酸同源性為95.1％-99.8％，其中與法國和新西蘭代表株

2、的親緣關(guān)系較近，而與美國、加拿大和澳大利亞代表株的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。9株P(guān)CV2的ORF2核苷酸及推導(dǎo)的氨基酸序列同源性分別為93.1％～100％和91.8％～99.6％，存在較大的變異。 對2005年12月31日前GenBank上已公布的26株P(guān)CV1和262株P(guān)CV2的全基因序列進(jìn)行了核苷酸的同源性比較，并對其ORF1和ORF2進(jìn)行了核苷酸和推導(dǎo)氨基酸序列的比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：從核苷酸水平來看，PCV1與PCV2明顯分為兩枝，PCV

3、1間分布沒有規(guī)律，而PCV2間又分為以來自美國、加拿大、澳大利亞的序列為代表的亞型Ⅰ和以來自法國和新西蘭的序列為代表的亞型Ⅱ，但從ORF1和ORF2氨基酸水平來看，其分型并沒有規(guī)律可循。對中國的97株P(guān)CV2核苷酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，來自廣西、湛江、海南的9株和臺灣的11株相對較集中，廣西、湛江、海南的9株同屬于亞型Ⅱ，臺灣的11株同屬于亞型Ⅰ，而來自其他各省的PCV2序列分布較復(fù)雜，大部分分布于亞型Ⅱ，少部分屬于亞型Ⅰ。從遺傳進(jìn)化樹可以

4、看出，PCV2的分布并沒有地域性和時(shí)序性。數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，盡管PCV2各毒株相隔近十年，但其同源性并沒有發(fā)生太大的改變，可見PCV2相當(dāng)保守。另外對PCV2的堿基和氨基酸突變位點(diǎn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)發(fā)現(xiàn)，PCV2序列間變化更傾向于堿基的顛換，但無單個(gè)堿基和氨基酸的偏好性。 豬2型圓環(huán)病毒(PCV2)是一種重要的免疫抑制性病原，近年來給養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，但到目前為止，還沒有找到有效的疫苗來預(yù)防此病的發(fā)生。本研究以PCDNA3為載體，與

5、PCV2廣西地方株的ORF2全序列、ORF2中的高變區(qū)V1、V2、V3、V1-V2連接，分別成功構(gòu)建了真核表達(dá)質(zhì)粒PCDNA3-ORF2、PCDNA3-V1、PCDNA3-V2、PCDNA3-V3和PCDNA3-V1-V2。對陽性真核表達(dá)質(zhì)粒大量生產(chǎn)并純化后，免疫5周齡左右的雌性小白鼠，每只200μg，然后分別于一免后7天、14天，二免后7天、14天用ELISA檢測免疫后小白鼠血清中抗體的產(chǎn)生情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)這5種真核表達(dá)質(zhì)粒均能刺激小白