狂犬病野毒株全基因組序列分析及分子進(jìn)化研究.pdf

1、狂犬病廣泛流行于世界各地，狂犬病毒具有多種動(dòng)物宿主，歐美的狂犬病主要以野生動(dòng)物為主，亞洲和非洲的狂犬病以家養(yǎng)動(dòng)物為主。目前狂犬病毒可分為7個(gè)基因型，還有幾株新分離的病毒尚需確立分類地位。中國自2000年以來狂犬病的流行呈逐年上升的趨勢(shì)，由于中國尚未開展大面積普遍的狂犬病流行病學(xué)調(diào)查，所以對(duì)中國境內(nèi)狂犬病的流行情況還不明確，為了有效防制狂犬病，非常有必要對(duì)自然界分離的狂犬病街毒進(jìn)行分子流行病學(xué)研究，以了解不同地域不同宿主病毒的流行特點(diǎn)。

2、 本研究所用的兩個(gè)毒株，DRV分離自吉林某鹿場(chǎng)患狂犬病的梅花鹿，MRV分離自河南某地狂犬病疫區(qū)野鼠體內(nèi)。兩個(gè)毒株具有不同的地域分布和不同的宿主特點(diǎn)，具有代表性。對(duì)于狂犬病野毒株的全基因組序列測(cè)定和分析在我國尚屬首次。 本研究主要采取RT-PCR產(chǎn)物克隆的方法進(jìn)行毒株全基因組擴(kuò)增克隆和測(cè)序，病毒基因組末端測(cè)序采取3’-RACE和5’-RACE方法。根據(jù)己測(cè)定的狂犬病毒株全基因組序列，用分子生物學(xué)軟件設(shè)計(jì)了用于3’-RACE的

3、接頭引物一對(duì)，用于5’-RACE的2對(duì)嵌套引物、1條5’磷酸化引物，用于普通PCR的8對(duì)引物，這些引物擴(kuò)增序列覆蓋了整個(gè)病毒全基因組序列，具有一定的重疊區(qū)域。PCR產(chǎn)物純化回收后直接與T載體連接轉(zhuǎn)化克隆，鑒定的陽性克隆菌株送生物公司測(cè)序，陽性克隆菌種加甘油冷凍保存。 PCR產(chǎn)物克隆測(cè)序結(jié)果經(jīng)NCBI在線BLAST搜索驗(yàn)證后，用分子生物學(xué)軟件進(jìn)行序列的拼接和注釋，得到了兩株狂犬病野毒株的全基因組序列，其中DRV株全基因組序列長11

4、863bp，MRV株全基因組序列長11869bp。在測(cè)定的全基因組cDNA序列上，每個(gè)毒株都由5個(gè)基因組成，每個(gè)基因編碼區(qū)的起始密碼子都為“ATG”，終止密碼子為“TAA”或“TGA”，各基因轉(zhuǎn)錄信號(hào)位點(diǎn)準(zhǔn)確，與其他已測(cè)定的基因1型狂犬病毒株比較各個(gè)基因的編碼長度沒有改變，說明本實(shí)驗(yàn)所測(cè)定的兩個(gè)毒株基因編碼區(qū)沒有發(fā)生插入和缺失的變異發(fā)生。 應(yīng)用生物信息學(xué)的理論和方法，利用各種基因信息資源和基因數(shù)據(jù)庫(NCBI、EMBL等)，以測(cè)

5、定的兩個(gè)狂犬病毒野毒株全基因組核苷酸序列為基礎(chǔ)，運(yùn)用多種分子生物學(xué)軟件對(duì)兩個(gè)狂犬病毒野毒株的基因組結(jié)構(gòu)進(jìn)行全面的分析與比較，并對(duì)組成狂犬病毒基因組的5個(gè)基因分別進(jìn)行了多重序列同源性分析和比對(duì)，得到了5個(gè)基因的分子進(jìn)化樹。 分析比較結(jié)果顯示，本研究所測(cè)定的兩個(gè)毒株在非編碼區(qū)有多種變異形式發(fā)生，包括核苷酸的替換、插入、缺失，但是非編碼區(qū)轉(zhuǎn)錄起始和終止信號(hào)“UUGU”、“UUUUUUU”沒有變異，在非編碼區(qū)有一些序列存在著高度的保守性

6、，估計(jì)與基因的轉(zhuǎn)錄直接相關(guān)。在編碼區(qū)沒有插入和缺失的變異發(fā)生，主要是核苷酸的替代，對(duì)主要功能位點(diǎn)的比較發(fā)現(xiàn)，兩個(gè)毒株在N基因、G基因的主要抗原部位都有氨基酸的突變發(fā)生，這些突變將直接影響到病毒毒力的變化和免疫原性。對(duì)各個(gè)基因5’端非編碼區(qū)RNA二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果顯示，兩個(gè)毒株的基因5’端非編碼區(qū)盡管有核苷酸序列的變異，但是二級(jí)結(jié)構(gòu)相似，而且各個(gè)基因的5’端非編碼區(qū)具有類似的結(jié)構(gòu)。對(duì)5個(gè)基因的蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行了預(yù)測(cè)和分析，在疏水結(jié)構(gòu)和親水

7、結(jié)構(gòu)方面，兩個(gè)毒株沒有明顯的變異發(fā)生。 根據(jù)GenBank或相關(guān)論文的資料，選取有代表性和背景資料確定的毒株序列，分別對(duì)5個(gè)基因進(jìn)行多重序列同源性分析和比對(duì)，DRV和MRV之間N、NS、M、G、L基因的同源性分別為91％、91％、95％、91％、91.3％;與DRV同源性最高的分別是：3aG為94％(N)、Nishigahara為95％(NS)、RH-CL為98％(M)、3aG為95％(G)、Ni-CE為98％(L)；與MRV同

8、源性最高的分別是：CVS為99％(N)、AV01為98％(NS)、CVS為99％(M)、CVS-N2C為98％(G)、PMl503為99.2％(L)。 對(duì)狂犬病毒基因組5個(gè)基因的分子進(jìn)化樹分析表明，為了逃避宿主的免疫壓力，G基因的進(jìn)化最快速，而且具有宿主的特異性，在G基因的進(jìn)化中，DRV和MRV分別位于不同的組群，DRV與中國人用疫苗株和日本疫苗株在一個(gè)組群，MRV與CVS以及犬腦分離的街毒歸在一個(gè)組群，結(jié)合其他基因的進(jìn)化樹表明