偽狂犬病病毒高溫傳代毒株生物學(xué)特性改變的分子基礎(chǔ).pdf

1、自2011年以來，我國許多偽狂犬病疫苗免疫豬場發(fā)生了由偽狂犬病毒變異毒株引起的偽狂犬病，給我國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟損失。對于偽狂犬病病毒變異毒株的攻擊，Bartha-K61等傳統(tǒng)的疫苗已經(jīng)無法為免疫豬提供完全的保護。2012年，本課題組從江蘇省疑似發(fā)生偽狂犬病的仔豬中，分離到了一株偽狂犬病病毒變異毒株（JS-2012株）。在40℃條件下，把該變異毒株在Vero細(xì)胞上連續(xù)傳代培養(yǎng)120代，獲得了一株毒力減弱的偽狂犬病病毒（JS-2012

2、-F120株）。與變異毒株JS-2012相比，JS-2012-F120接種仔豬不引起任何臨床癥狀，而且其相關(guān)生物學(xué)特性，如蝕斑大小和病毒滴度也發(fā)生了改變。
　　本研究通過蝕斑實驗，病毒生長曲線以及小鼠感染實驗研究了各個代次病毒（第25、45、50、71、91、110和120代病毒）的生物學(xué)特性。結(jié)果表明，隨著傳代次數(shù)的增加，病毒滴度呈現(xiàn)出逐漸增高的趨勢。第120代病毒（JS-2012-F120株）病毒滴度可以達(dá)到1090 TCID

3、50/ml，明顯高于母源毒株（JS-2012株）的滴度(1070 TCID50/ml)。另外，第50代病毒（JS-2012-F50株）的蝕斑大小只有母源毒株（JS-2012株）50％，而第120代病毒（JS-2012-F120株）的蝕斑大小達(dá)到母源毒株（JS-2012株）的95％。此外，隨著傳代次數(shù)的增加，病毒對小鼠的致病力也逐漸減弱。變異毒株（JS-2012株）接種組小鼠的發(fā)病率和死亡率分別為100％和50％，而第120代病毒（JS-

4、2012-F120株）接種組小鼠發(fā)病率只有30％，并且沒有小鼠死亡。
　　為了探索偽狂犬病病毒高溫傳代毒株生物學(xué)特性改變的分子基礎(chǔ)，本研究通過高通量測序并結(jié)合常規(guī)測序方法獲得了不同代次病毒（第25、45、50、71、91、110和120代病毒）的基因編碼區(qū)(CDS)序列。序列比對分析結(jié)果顯示，與變異毒株JS-2012相比，第120代病毒JS-2012-F120在gE gI基因區(qū)域，有2307個堿基缺失;在IE180，UL18，UL

5、44和UL50蛋白上有4個氨基酸突變，并且在UL16和UL46基因均存在+1位移碼突變。UL16基因的952位有1個胞嘧啶(C)核苷酸插入，導(dǎo)致C端有13個氨基酸突變;UL46基因的1796位有29個堿基插入，導(dǎo)致C端有130個氨基酸突變。gE-US2基因區(qū)域2307個堿基的缺失可能是毒力減弱和蝕斑減小的主要因素;此外，UL16和UL46基因移碼突變可能與毒力減弱相關(guān);gC蛋白的點突變(G90D)可能增強了病毒在細(xì)胞間的傳播能力。上述結(jié)

6、果有助于我們更加深入地了解偽狂犬病毒的致病機理及其生長特性。
　　本研究通過3'RACE、Western-blot和IFA實驗的方法從轉(zhuǎn)錄水平及蛋白水平驗證了UL16和UL46基因的移碼突變現(xiàn)象。證實該移碼突變并未使這兩個基因的功能完全喪失，而只是使編碼區(qū)延長終止，最終導(dǎo)致3'端氨基酸發(fā)生了突變。偽狂犬病毒基因組結(jié)構(gòu)極其穩(wěn)定，病毒發(fā)生移碼突變現(xiàn)象極為罕見。本研究結(jié)果有助于我們更深入地了解偽狂犬病毒UL16和UL46的基因功能。

7、r>　　為制備偽狂犬病病毒變異株gE蛋白的單克隆抗體，將gE蛋白主要抗原表位區(qū)在大腸桿菌中進行了表達(dá)。用純化的融合蛋白免疫6周齡BALB/c雌性小鼠，經(jīng)細(xì)胞融合和篩選，獲得了4株穩(wěn)定分泌抗gE蛋白單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞（2E5，5C3，5B2和6E6）。間接免疫熒光試驗(IFA)顯示四株單克隆抗體均能與PRV變異株(JS-2012)反應(yīng)，但與gE缺失的疫苗毒Bartha-K61株無反應(yīng)。而Western blot結(jié)果顯示只有5C3和2E