豬2型圓環(huán)病毒全基因組的測(cè)序分析和感染克隆研究.pdf

1、豬2型圓環(huán)病毒（Porcine circovirus2，PCV2），是至今為止發(fā)現(xiàn)的最小的動(dòng)物病毒之一。其主要引起斷奶仔豬多系統(tǒng)衰竭綜合征，對(duì)規(guī)?；B(yǎng)殖場(chǎng)造成了不可估量的損失。由于其可引起免疫器官的病理變化，使豬自身的免疫系統(tǒng)受損，更加劇了其他病原菌的侵入，加重病情。現(xiàn)在越來(lái)越受到養(yǎng)殖者和科研工作者的關(guān)注。
　　本試驗(yàn)從山東省收集了多份PMWS疑似病料，并根據(jù)PCV2的Cap蛋白通過(guò)Prime5設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物，用來(lái)檢測(cè)。將陽(yáng)

2、性病料再經(jīng)過(guò)磷鎢酸染色，在透射電鏡下觀察。萊西的病料中觀察到了17 nm左右的PCV2病毒粒子。并將病料接種到PK-15細(xì)胞中，用D-氨基葡萄糖處理，增加病毒的感染量。連續(xù)盲傳6代，并用PCR來(lái)檢測(cè)每代收獲的病毒液。經(jīng)檢測(cè)，全為陽(yáng)性。為接下來(lái)的試驗(yàn)提供了試驗(yàn)材料。
　　根據(jù)GenBank中己發(fā)表的PCV2全基因序列，設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，用PCR方法直接從接毒細(xì)胞中擴(kuò)增出PCV2的全基因組序列。將擴(kuò)增片段克隆于pMD19-T載體進(jìn)行

3、測(cè)序，結(jié)果表明PCV2基因組全長(zhǎng)為1767bp。應(yīng)用DNAstar分析結(jié)果表明，在1479 bp-1468 bp處都含有特殊的TCA/AAC/CCC/CG(T)C序列，所以基因型為PCV2-1型。同時(shí)與選取的國(guó)內(nèi)外23株已公布的序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)比較，確定其基因亞型為PCV2-1B，并命名為L(zhǎng)X株。再選取山東地區(qū)的6株序列進(jìn)行分析，核苷酸序列的同源性均超過(guò)96.9％，同源性較高，其3個(gè)ORF均出現(xiàn)了突變。ORF1和ORF3沒(méi)有引起氨基酸

4、的變化，而ORF2有2處氨基酸發(fā)生突變，128 R-W，179 S-F，而128位位于PCV2獨(dú)特的抗原位點(diǎn)，推測(cè)影響PCV2的抗原性，進(jìn)而影響毒力。
　　將pMD19-T-PCV2用SacⅡ單酶切，回收PCV2全基因。同時(shí)將目的載體pBLuescript KS載體用SacⅡ單酶切回收，并用去磷酸化酶CIAP處理，防止載體自連。將PCV2-1B與pBluescript KS連接，獲得了兩個(gè)重組克隆載體，分別命名為pBluescri