豬流行性腹瀉病毒感染性克隆的構(gòu)建及豬圓環(huán)病毒2型感染豬肺泡巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究.pdf

1、豬流行性腹瀉（Porcine epidemic diarrhea, PED）是一種急性、高度傳播性的腸道疾病，該病由豬流行性腹瀉病毒（Porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起，以急性腸炎、嘔吐、水樣腹瀉和脫水等為主要臨床特征。PED于2010年起在中國(guó)再次爆發(fā)，該次流行主要以變異毒株的出現(xiàn)為特征，造成80％-100％的哺乳仔豬發(fā)病，50％-90％的仔豬死亡。后來(lái)該病于2013年5月在美國(guó)爆發(fā)，給養(yǎng)豬

2、業(yè)帶來(lái)了極大的經(jīng)濟(jì)損失。
　　豬圓環(huán)病毒2型(Porcine circovirus type2，PCV2)是引起豬圓環(huán)病毒相關(guān)疾病的重要病原，給當(dāng)前養(yǎng)豬業(yè)造成極大的經(jīng)濟(jì)損失，其靶細(xì)胞主要是單核巨噬細(xì)胞系統(tǒng)和樹(shù)突狀細(xì)胞，其感染后主要的臨床組織病變?yōu)榱馨图?xì)胞減少和炎性細(xì)胞浸潤(rùn)，最終導(dǎo)致機(jī)體免疫功能抑制，從而繼發(fā)感染其他細(xì)菌和病毒。
　　本論文針對(duì)這兩種豬的重要病原，主要研究?jī)?nèi)容如下:
　　1.PEDV的流行病學(xué)調(diào)查通過(guò)對(duì)2

3、011年2月至2011年10月間從華中、華東、華南、西南地區(qū)12個(gè)省份的57個(gè)豬場(chǎng)采的455份臨床樣品（包括糞便樣品、小腸樣品和乳汁樣品），用RT-PCR檢測(cè)方法檢測(cè)，結(jié)果顯示，有45個(gè)豬場(chǎng)的278份樣品為PEDV陽(yáng)性，豬場(chǎng)陽(yáng)性率為78.95％，樣品陽(yáng)性率為61.11％，這些陽(yáng)性樣品包括253份糞便樣品、20份小腸樣品、5份乳汁樣品，總樣品陽(yáng)性率為61.11％，表明PEDV在我國(guó)流行十分廣泛，感染率相當(dāng)高，同時(shí)本研究還從乳汁中檢測(cè)到PE

4、DV陽(yáng)性，說(shuō)明PEDV可能通過(guò)母乳垂直傳播給哺乳仔豬。
　　2.PEDV CHGDU株的分離與鑒定盡管PEDV的感染率很高，豬流行性腹瀉病毒的分離仍然十分困難。本研究將采自廣東省某豬場(chǎng)發(fā)病仔豬的小腸樣品處理后，接種Vero-CCL81細(xì)胞，同時(shí)維持液中添加15μg/mL胰蛋白酶，盲傳3代后，有一份小腸樣品接種的細(xì)胞觀察到明顯的PEDV特征性的多核細(xì)胞體病變，分離到的病毒通過(guò)RT-PCR和IFA檢測(cè)，證實(shí)PEDV陽(yáng)性，將該分離株命名

5、為CHGDU。
　　3.PEDV CHGDU株S基因全長(zhǎng)測(cè)定及分析通過(guò)對(duì)CHGDU毒株S基因全長(zhǎng)測(cè)定及分析發(fā)現(xiàn)，該毒株與NCBI中登錄的另一毒株GD-A毒株S基因的序列同源性為100％，進(jìn)一步分析S基因的序列特征發(fā)現(xiàn)該毒株屬于變異毒株，通過(guò)與疫苗株CV777 S蛋白相應(yīng)區(qū)域分析結(jié)果表明:中和表位COE區(qū)域存在3個(gè)氨基酸突變（T554S、G599S和Q638S），而另一中和表位S1D區(qū)域包含5個(gè)氨基酸的突變(N724S、N728S、

6、P768R、L769S和D771S)，與CV777相比，CHGDU在S1/S2結(jié)合位(P768R)和S2'位點(diǎn)突變?yōu)榫彼?G896R)，這些位點(diǎn)可被蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化酶PC(proprotein convertase，PC)所識(shí)別和切割，從而增強(qiáng)病毒致細(xì)胞病變的能力和毒力。將CHGDU株的S基因與已測(cè)定的其他152株GenBank登錄的S基因全長(zhǎng)序列進(jìn)行比較，并利用MEGA6軟件繪制系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，發(fā)現(xiàn)這些毒株可分為兩個(gè)大群即Genogroup1

7、和Genogroup2;其中這兩個(gè)群又被分為兩個(gè)亞群即1a、1b及2a、2b。Genogroup1群主要由2010年以后分離和報(bào)道的中國(guó)毒株以及2013年和2014年美國(guó)流行毒株組成，其中CHGDU株屬于1a群，屬于PEDV變異株，該毒株與處于2b亞群的疫苗毒株DR13和CV777遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)。
　　4.病毒的S基因全長(zhǎng)克隆及重組病毒rPEDV-DR13-SCHGDU-Flag-dORF3/GFP的拯救為進(jìn)一步驗(yàn)證S基因在病毒致病

8、過(guò)程中的作用，本研究首先克隆了CHGDU的S基因全長(zhǎng)，成功構(gòu)建表達(dá)載體PCAGGS-CHGDU-S-Flag，通過(guò)轉(zhuǎn)染Vero-CCL81，IFA驗(yàn)證S基因能順利表達(dá)，并在5μg/mL胰蛋白酶存在的條件下誘導(dǎo)細(xì)胞和細(xì)胞的融合，進(jìn)一步將該基因克隆至穿梭載體，成功構(gòu)建穿梭載體pPEDV-CHGDU-S-Flag-dORF3/GFP，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄RNA，電轉(zhuǎn)至含有鼠肝炎病毒S基因的重組病毒mPEDV感染的Vero-CCM細(xì)胞中，通過(guò)定向重組的

9、方法拯救出重組病毒rPEDV-DR13-SCHGDU-Flag-dORF3/GFP，并且驗(yàn)證該毒株在培養(yǎng)過(guò)程中需要外源添加胰蛋白酶，證明S基因是決定PEDV毒株對(duì)胰蛋白酶依賴(lài)的關(guān)鍵基因。
　　5.Vero-hTMPRSS2-HA細(xì)胞系的構(gòu)建與hTMPRSS2在病毒感染過(guò)程中作用的研究首先克隆了人絲氨酸蛋白酶TMPRSS2基因，構(gòu)建了含有HA標(biāo)簽的表達(dá)質(zhì)粒PQCXIN-hTMPRSS2-HA，Western-blot證實(shí)該蛋白正確表

10、達(dá)，利用MLV系統(tǒng)，構(gòu)建穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系Vero-hTMPRSS2-HA，并對(duì)細(xì)胞系進(jìn)行了IFA和Western-blot檢測(cè)hTMPRSS2的表達(dá)，證實(shí)穩(wěn)定表達(dá)hTMPRSS2的細(xì)胞系構(gòu)建成功，再利用含有GFP重組病毒為工具，測(cè)定了hTMPRSS2在病毒感染和釋放過(guò)程中的作用，結(jié)果表明，hTMPRSS2在病毒入侵和釋放過(guò)程中均沒(méi)有明顯的作用。
　　6.豬圓環(huán)病毒2型感染豬肺泡巨噬細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究本研究采用WH株體外感染豬原代肺泡

11、巨噬細(xì)胞，分別在感染后24小時(shí)和48小時(shí)取樣進(jìn)行全基因組表達(dá)譜分析，結(jié)果顯示:24小時(shí)感染組中共有266個(gè)基因差異表達(dá)，其中包括212個(gè)上調(diào)表達(dá)和54個(gè)下調(diào)表達(dá)的差異基因;48小時(shí)感染組中共有175個(gè)基因差異表達(dá)，其中包括150個(gè)上調(diào)表達(dá)和25個(gè)下調(diào)表達(dá)的差異基因，但兩組間相互比較，僅有6個(gè)基因差異表達(dá)。24小時(shí)感染組差異表達(dá)基因主要與細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)、血液系統(tǒng)的形成和功能、免疫細(xì)胞運(yùn)輸、細(xì)胞-細(xì)胞間的信號(hào)傳遞和相互作用和腎臟相關(guān)疾病等功能相