豬流行性腹瀉病毒全長(zhǎng)cDNA克隆及復(fù)制子的構(gòu)建.pdf

1、豬流行性腹瀉是豬的一種急性、高度接觸性的腸道傳染病，由豬流行性腹瀉病毒(PEDV)所引起。該病以急性腸炎、嘔吐、水樣腹瀉和食欲下降為基本特征。各年齡豬均易感，但以新生仔豬最為嚴(yán)重，其發(fā)病率和死亡率可達(dá)90％-100％。盡管該病首先發(fā)現(xiàn)于歐洲，但其廣泛流行于包括中國(guó)、韓國(guó)、菲律賓等在內(nèi)的許多亞洲國(guó)家，并已成為嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的主要傳染病之一。反向遺傳操作系統(tǒng)可為研究病毒的復(fù)制與轉(zhuǎn)錄機(jī)制及各基因的功能等提供有用的工具。因此，本研究以PEDV流

2、行毒株AJ1102為研究對(duì)象，開展了PEDV反向遺傳操作系統(tǒng)的相關(guān)構(gòu)建工作，主要內(nèi)容包括:
　　1.PEDV全長(zhǎng)cDNA克隆的構(gòu)建
　　根據(jù)PEDV AJ1102株的全基因組序列設(shè)計(jì)引物，利用RT-PCR以及融合PCR的方法擴(kuò)增獲得覆蓋PEDV AJ1102株全基因組的6個(gè)片段(A、B、C、D、EF、G)，擴(kuò)增的同時(shí)在A片段的5，端引入正確的CMV啟動(dòng)子序列。通過對(duì)細(xì)菌人工染色體pBelo BAC11載體進(jìn)行改造，構(gòu)建了含有

3、CMV早期啟動(dòng)子序列、PEDV5'端序列、多克隆位點(diǎn)、PEDV3'端序列、核酶HDV序列和BGH終止序列的中間載體pBelo-AJ1102-5'-3'。將獲得的6個(gè)片段依次克隆到pBelo-AJ1102-5'-3'中間載體上，獲得該毒株全長(zhǎng)cDNA克隆pBelo-AJ1102，為進(jìn)一步構(gòu)建其感染性克隆奠定了基礎(chǔ)。
　　2.PEDV復(fù)制子的構(gòu)建
　　在構(gòu)建PEDV AJ1102株全長(zhǎng)cDNA克隆的基礎(chǔ)上，同時(shí)構(gòu)建了PEDV復(fù)制

4、子的cDNA克隆。首先利用PCR方法對(duì)EF片段上的S、ORF3、E、M基因進(jìn)行缺失，而保留與豬流行性腹瀉病毒復(fù)制相關(guān)的N蛋白基因序列以及N基因上游的TRS序列，同時(shí)分別引入Luc和EGFP報(bào)告基因，將改造后的EF片段分別命名為H(H-EGFP)片段和I(I-Luc)。同構(gòu)建PEDV全長(zhǎng)cDNA克隆一樣，將H、I片段分別克隆到pBelo-ABDG中間載體上后插入C片段，分別獲得含有Luc和EGFP報(bào)告基因的復(fù)制子質(zhì)粒pBelo-AJ110