豬流行性腹瀉病毒檢測方法建立及基因變異分析.pdf

1、2010年底開始，豬病毒性腹瀉在我國許多地區(qū)出現(xiàn)暴發(fā)流行，為調(diào)查此次腹瀉疫情暴發(fā)的原因，本試驗建立了可同時檢測PEDV、TGEV、GARV和PKV的多重RT-PCR方法，用于臨床腹瀉豬糞便樣本的檢測。為提高對PEDV檢測的靈敏性和建立具有中和保護水平的抗體監(jiān)測方法，本試驗建立了檢測PEDV的巢式RT-PCR方法及基于S蛋白的間接ELISA方法，為臨床上PED流行病學及抗體水平監(jiān)測提供工具。另外，本研究通過對2010～2011年15株P(guān)E

2、DV華中地區(qū)毒株M和ORF3基因進行克隆、測序及遺傳進化分析，探討PED在我國再次暴發(fā)的原因。
　　1.PEDV、TGEV、GARV和PKV多重RT-PCR檢測方法的建立及臨床應(yīng)用
　　為調(diào)查導致此次我國豬腹瀉疫情大面積暴發(fā)原因，本研究建立了可同時檢測PEDV、TGEV、GARV和PKV的多重RT-PCR方法。應(yīng)用該方法對2010～2012年華中地區(qū)190份腹瀉仔豬樣本進行檢測，PEDV、TGEV、GARV和PKV的陽性率分

3、別為62.11％、0.53％、7.37％和82.11％。其中，PEDV和PKV混合感染率為47.89％，PEDV和GARV混合感染率為4.74％，GARV和PKV混合感染率為7.37％, PEDV、GARV和PKV混合感染率為4.74％，未發(fā)現(xiàn)TGEV與其它3種病毒的混合感染。另外，有27份樣本中僅檢出 PEDV(14.21％)，57份樣本只檢出PKV(30％)。結(jié)果表明，此次我國大面積暴發(fā)的病毒性腹瀉是多病原混合感染造成的，主要病原為

4、PEDV，PKV在其中所起作用尚待進一步驗證和研究。
　　2.PEDV巢式RT-PCR檢測方法的建立及初步應(yīng)用
　　為建立一種靈敏度高的PEDV病原檢測方法，根據(jù)GenBank中公布的PEDV M基因序列，分別設(shè)計合成針對M基因的內(nèi)、外2對特異性引物，在優(yōu)化反應(yīng)條件的基礎(chǔ)上建立了檢測PEDV的巢式RT-PCR方法。結(jié)果顯示，單獨使用外引物和內(nèi)引物建立的常規(guī)RT-PCR方法檢測限量均為50pg的PEDV RNA模板，而使用巢式

5、RT-PCR方法可以檢測到50fg的PEDV RNA模板。另外，該方法對PRRSV、CSFV、TGEV、GARV模板的RT-PCR擴增結(jié)果均為陰性。結(jié)果表明，建立的巢式RT-PCR方法特異性、敏感性良好，可以準確快速的檢測出樣本中微量的PEDV核酸。
　　3.PEDV河南流行毒株S基因部分片段的原核表達及間接ELISA方法的建立
　　為建立檢測抗PEDV S蛋白抗體的間接ELISA方法，應(yīng)用RT-PCR方法擴增PEDV河南流

6、行毒株S基因794bp片段，將其克隆至原核表達載體pET-32a(+)，構(gòu)建pET-32a-S重組質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化至宿主菌BL21(DE3)，在37℃條件下加入IPTG進行誘導表達，經(jīng)SDS-PAGE分析顯示該蛋白以融合蛋白形式高效表達，分子量約為46.9kD; Western-blot分析表明所表達的重組蛋白具有良好的反應(yīng)原性。以純化的S蛋白為包被抗原建立檢測PED抗體的間接ELISA方法，試驗確定抗原最佳包被量0.04μg/孔，血清最佳稀

7、釋度為1∶100，HRP-IgG最佳稀釋度為1∶2000，陽性標準判定為OD450≥0.24。應(yīng)用該方法對河南省不同地區(qū)23家豬場的279份血清樣本進行檢測，結(jié)果顯示，母豬血清樣本PED抗體陽性率為97.42％(227/233);育肥和保育豬血清樣本陽性率為71.74％(33/46)。結(jié)果表明，所建立的間接ELISA方法特異性、靈敏性和可重復(fù)性良好，可以用于豬群PED抗體水平監(jiān)測和流行病學調(diào)查。
　　4.2010～2011年華中地

8、區(qū)PEDV流行毒株基因變異分析
　　為研究PED再次在中國中部的暴發(fā)原因，對2010年10月至2011年12月之間收集于華中地區(qū)的15株P(guān)EDV流行毒株M和ORF3基因進行RT-PCR擴增、克隆、測序及分析。序列分析顯示PEDV華中地區(qū)毒株M和ORF3基因有些核苷酸及氨基酸發(fā)生改變;基于M和ORF3基因的遺傳進化分析顯示，PEDV可以分為3個群(G1，G2，G3)，15株P(guān)EDV華中地區(qū)毒株均屬于第3群，與2007年韓國株、200