豬傳染性胃腸炎和豬流行性腹瀉快速診斷方法的建立及S基因的表達(dá).pdf

1、豬傳染性胃腸炎病毒和豬流行性腹瀉病毒同屬于冠狀病毒，是引起豬腹瀉和仔豬死亡的兩種主要病原。本研究分別建立了普通雙重RT-PCR和雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR鑒別診斷PEDV和TGEV的方法以及實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR檢測(cè)豬流行性腹瀉病毒的方法；同時(shí)構(gòu)建了原核表達(dá)載體pET28a(+)-P-SP1，表達(dá)出了PEDV S蛋白，并對(duì)其免疫原性進(jìn)行檢測(cè)。主要研究?jī)?nèi)容如下： 根據(jù)GenBank上發(fā)表的豬流行性腹瀉病毒(PEDV) CV77

2、7株和豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV) Purdue P115株的基因序列，針對(duì)其基因保守區(qū)，設(shè)計(jì)一條共用的下游引物和兩條各自病毒基因的上游引物，可特異擴(kuò)增出大小分別為213bp和546bp目的條帶。特異性和敏感性檢測(cè)結(jié)果顯示所建立的檢測(cè)方法具有很好的特異性以及較高的敏感性，為實(shí)驗(yàn)室診斷PEDV和TGEV提供了一種較為快速的手段。 根據(jù)GenBank中公布的豬流行性腹瀉病毒N基因序列，設(shè)計(jì)了一對(duì)特異性引物和探針，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度為18

3、6bp的片段。以克隆了N基因的質(zhì)粒作為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，利用ABI7300熒光定量PCR儀，建立了一種敏感、特異、重復(fù)性好的快速檢測(cè)豬流行腹瀉病毒含量的TaqMan熒光定量RT-PCR方法。該方法在101～108拷貝/μL范圍內(nèi)具有良好的線性關(guān)系，可檢測(cè)到初始模板中10拷貝/μL的質(zhì)粒DNA，以豬圓環(huán)病毒、豬乙腦病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病毒和豬細(xì)小病毒為模板時(shí)，均檢測(cè)不到熒光信號(hào)，而重復(fù)性實(shí)驗(yàn)中其變異系數(shù)均小于2％，從

4、而表明此方法具有很好的特異性和重復(fù)性。 根據(jù)TaqMan探針熒光定量分析原理，以FAM和JOE標(biāo)記探針，設(shè)計(jì)兩對(duì)引物和兩條探針，通過(guò)對(duì)反應(yīng)條件的優(yōu)化，以T7體外轉(zhuǎn)錄得到的RNA為標(biāo)準(zhǔn)品，建立了一種TaqMan雙重實(shí)時(shí)熒光定量RT-PCR(FQ-RT-PCR)檢測(cè)PEDV和TGEV的方法。該方法具有良好的敏感性、重復(fù)性和特異性，能夠檢測(cè)到2×101拷貝/μL的病毒RNA，重復(fù)性試驗(yàn)中Ct值變異系數(shù)CV％均不超過(guò)2％，以豬圓環(huán)病毒、

5、豬乙腦病毒、豬瘟病毒、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬偽狂犬病毒和豬細(xì)小病毒為模板進(jìn)行FQ-RT-PCR時(shí)，均檢測(cè)不到熒光信號(hào)。 參照GenBank中所收錄的豬流行性腹瀉病毒(PEDV) CV777株S基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)特異性引物，去除信號(hào)肽，以PEDV CH/ZJ株為模板，通過(guò)RT-PCR擴(kuò)增出目的基因，克隆入原核表達(dá)載體pET28a(+)，轉(zhuǎn)化到Top10感受態(tài)細(xì)胞中，測(cè)序并分析，將重組質(zhì)粒命名為pET-P-SP1。將pET-P-S