間接ELISA檢測(cè)豬傳染性胃腸炎與豬呼吸道冠狀病毒抗體的方法建立.pdf

1、本研究對(duì)TGEVSBC蛋白（在PRCV中缺失）和TGEVN蛋白(TGEV與PRCV共有)進(jìn)行了原核表達(dá)，建立了以重組SBC和N蛋白為抗原的檢測(cè)TGEV與PRCV抗體的間接ELISA方法。主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　 1.TGEV重組SBC和N蛋白的表達(dá)與純化
　　 將構(gòu)建保存的重組表達(dá)菌pET32a-SBCBL21(DE3)和pET32a-NBL21(DE3)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)。表達(dá)產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE電泳分析，誘導(dǎo)的pET32

2、a-SBC和pET32a-N分別獲得了3.8kDa和67kDa大小的濃縮蛋白帶。對(duì)重組SBC和N蛋白進(jìn)行純化。蛋白質(zhì)免疫印跡結(jié)果顯示，重組的TGEVSBC和N蛋白與抗TGEV的豬血清發(fā)生特異性反應(yīng)，表明其具有抗原活性。
　　 2.TGEV重組SBC和N蛋白作為包被抗原，建立檢測(cè)TGEV與PRCV抗體的間接ELISA方法
　　 分別以TGEV重組SBC和N蛋白作為包被抗原篩選確定了間接ELISA檢測(cè)TGEV與PRCV抗體的

3、最佳反應(yīng)條件：重組SBC和N蛋白最佳抗原包被濃度分別為1.4μg/ml（稀釋160倍）和1.1μg/ml（稀釋320倍）；血清的稀釋度分別為320和640倍；PBST稀釋液中蛋白穩(wěn)定劑為5％小牛血清；封閉液分別為2％脫脂牛奶和5％小牛血清，于37℃封閉90min；酶標(biāo)二抗反應(yīng)條件分別為4800倍和9600倍稀釋，37℃孵育,30min；SBC和N蛋白包被孔的陽(yáng)性臨界值分別為0.1417和0.1958。
　　 特異性結(jié)果顯示，SB

4、C和N蛋白包被孔與豬流行性腹瀉病毒、豬大腸桿菌病、豬輪狀病毒、豬瘟病毒、豬細(xì)小病毒、豬偽狂犬病毒、豬呼吸與繁殖障礙綜合癥病毒的陽(yáng)性血清、PBS均不發(fā)生交叉反應(yīng)。SBC蛋白包被孔不與PRCV陽(yáng)性血清發(fā)生交叉反應(yīng)，而N蛋白包被孔與PRCV陽(yáng)性血清發(fā)生交叉反應(yīng)。ELISA的重復(fù)性結(jié)果顯示：SBC蛋白包被孔的批內(nèi)與批間檢測(cè)結(jié)果的變異系數(shù)低于10％，而N蛋白包被孔的批內(nèi)與批間平均變異系數(shù)分別低于10％及11％。
　　 3.TGEV與PRC