豬傳染性胃腸炎病毒單克隆抗體的制備與鑒定.pdf

1、豬傳染性胃腸炎(Transmissible Gastroenieritis of swine, TGE)是一種以仔豬出現(xiàn)嚴(yán)重腹瀉、嘔吐和脫水為特征的高度接觸性腸道傳染病，其病原為豬傳染性胃腸炎病毒(Transmissible Gastroenteritis Virus of Swine，TGEV)。臨床上TGEV與同種屬的其他腹瀉病毒難于區(qū)分，致使對該病的診斷和預(yù)防帶來了很大困難。由于單克隆抗體對抗原的識別具有特異性，因此在疫病病原的診

2、斷中優(yōu)勢突出。而單克隆抗體識別的抗原表位，有助于了解TGEV抗原結(jié)構(gòu)與功能的關(guān)系，對該病的診斷具有重要意義。本研究首先用差速離心的方法純化TGEV，以純化病毒為免疫抗原，經(jīng)皮下多點(diǎn)注射免疫BABL/c小鼠，三次免疫后進(jìn)行細(xì)胞融合，利用TGEV感染的PK15細(xì)胞進(jìn)行間接免疫熒光檢測，篩選陽性雜交瘤細(xì)胞株，并利用有限稀釋法克隆陽性細(xì)胞株，對經(jīng)三輪以上篩選為陽性的細(xì)胞株進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)和低溫凍存，同時(shí)利用BABL/c小鼠制備腹水進(jìn)一步驗(yàn)證，試驗(yàn)結(jié)

3、果表明我們獲得了一株能穩(wěn)定分泌抗TGEV抗體的雜交瘤細(xì)胞株，命名為4E2。利用純化的TGEV對4E2單克隆抗體進(jìn)行Westernblot分析，結(jié)果顯示單克隆抗體4E2特異性識別約為47kD的N蛋白。為了進(jìn)一步確定單抗4E2所識別的病毒蛋白，我們克隆獲得了TGEV的N基因，同時(shí)將N基因分成N1和N2，分別將其亞克隆至原核表達(dá)載體pGEX6p-1、pET-30a中，獲得重組表達(dá)載體pGEX6p-N、pET-30a-N1，并分別在大腸桿菌中進(jìn)

4、行了表達(dá)，利用TGEV陽性鼠血清對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行Western blot分析，證實(shí)表達(dá)的兩個融合蛋白都具有較好的反應(yīng)活性。然后分別以表達(dá)的融合蛋白為抗原，對獲得的單抗4E2進(jìn)行間接ELISA和Western blot檢測，結(jié)果顯示單抗4E2可以特異性識別TGEV N蛋白以及N1蛋白，進(jìn)一步證實(shí)我們獲得的單抗4E2是針對TGEV N蛋白，而且其所識別的抗原表位位于N蛋白N端192個氨基酸，本研究結(jié)果為今后臨床中對TGEV的可靠性診斷提供了有

5、效工具。
　　為弄清近年在上海某豬場發(fā)生的仔豬腹瀉疫情病因，我們隨機(jī)采集發(fā)病豬場的仔豬腹瀉樣品9份，利用RT-PCR方法對采集樣品進(jìn)行病原檢測，結(jié)果顯示，9份臨床樣品中有4份為豬輪狀病毒(PorcineRotavirus，PoRV)陽性，而豬流行性腹瀉病毒(PEDV)和TGEV均為陰性;根據(jù)GenBank公布的PoRV參考株序列設(shè)計(jì)兩對引物，對其中陽性樣品的VP6和VP7基因進(jìn)行RT-PCR擴(kuò)增、基因克隆和序列測定分析，結(jié)果顯示，