傳染性胃腸炎病毒SAD蛋白單克隆抗體制備與抗原表位鑒定.pdf

1、豬傳染性胃腸炎病毒(TGEV)，屬于冠狀病毒科冠狀病毒屬，是一種急性高度接觸性腸道傳染病，能夠引起各年齡段的豬產(chǎn)生嚴(yán)重的嘔吐、脫水和腹瀉。TGEV經(jīng)常會對大規(guī)模的哺乳豬造成巨大的經(jīng)濟損失。S蛋白是TGEV冠狀病毒關(guān)鍵的結(jié)構(gòu)蛋白，S蛋白是Ⅰ型跨膜蛋白位于病毒的表面，對于介導(dǎo)病毒粒子結(jié)合特異性的細(xì)胞受體是有作用的。S蛋白有四個抗原表位A，B，C和D，位于S蛋白N末端附近，其中編碼抗原位點的A和D區(qū)域這里定義為SAD，SAD是最具有誘導(dǎo)中和抗

2、體產(chǎn)生的區(qū)域。因此，對該段基因的研究，在豬傳染性胃腸炎病毒的抗病毒研究領(lǐng)域中具有重要價值。
　　在本次研究中，我們從TGEV中克隆SAD基因，通過雙酶切連接轉(zhuǎn)化成功構(gòu)建pET-30a-SAD質(zhì)粒，將包含SAD(1102 bp-1812 bp)基因片段的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)進E.coli BL21中，在37℃溫箱中培養(yǎng)過夜，陽性的菌液在大腸桿菌中經(jīng)過37℃搖床培養(yǎng)7h，經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后獲得大量表達(dá)的SAD蛋白，表達(dá)的產(chǎn)物用SDS-PAGE分析

3、，該蛋白是大小為34kDa以包涵體形式存在的蛋白。將純化的重組SAD蛋白免疫BALB/c小鼠，把骨髓瘤SP2/0細(xì)胞與免疫鼠脾細(xì)胞融合產(chǎn)生雜交瘤細(xì)胞。通過間接ELISA方法進行陽性克隆篩選，通過有限稀釋的方法獲得陽性克隆株進行擴大培養(yǎng)，最終獲得針對豬傳染性胃腸炎病毒SAD的單克隆抗體(MAb)2B10。應(yīng)用免疫印跡實驗(Western blot)和間接免疫熒光實驗(IFA)可知，MAb2B10能和TGEVSAD蛋白發(fā)生特異性反應(yīng)而且免疫

4、熒光顯示單克隆抗體能檢測到感染TGEV的細(xì)胞。通過抗體亞類檢測，2B10株屬于IgG2b亞類、K鏈。在研究中獲得的單克隆抗體能特異性的識別TGEV,而不與其他病毒反應(yīng)。
　　用純化的腹水作為靶分子，按照隨機噬菌體十二肽庫操作指南進行4輪篩選，按照投入噬菌體的量一致，包被的抗體濃度逐漸減少，Tween-20的濃度逐漸增大的方法篩選出具有高親和力的噬菌體克隆。對獲得的28個噬菌體克隆進行ELISA結(jié)合實驗，選出結(jié)合力最強的10個與TG