豬流行性腹瀉病毒中國(guó)流行株的上傳變異分析與S基因高變區(qū)的表達(dá).pdf

1、自2010年10月份起，由豬流行性腹瀉病毒（porcine epidemic diarrhea virus，PEDV）引起的豬急性腹瀉在中國(guó)多個(gè)養(yǎng)豬省份暴發(fā)。該病是以腹瀉、嘔吐、脫水和對(duì)哺乳仔豬高致死率為特征的一種高度接觸性腸道傳染病，易感豬發(fā)病率可高達(dá)100％，給豬場(chǎng)帶來(lái)了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。
　　為了解PEDV的遺傳變異情況，本研究根據(jù)GeneBank中PEDV經(jīng)典毒株CV777株的全序列設(shè)計(jì)了19對(duì)特異性引物，采用RT-PCR方

2、法對(duì)分離自河南省某豬場(chǎng)的PEDV流行株CH/ZMDZY/11的全基因組進(jìn)行分段擴(kuò)增、克隆和測(cè)序，獲得了基因組的完整序列。在此基礎(chǔ)上，作者對(duì)2010-2012年間PEDV中國(guó)流行株的遺傳變異情況進(jìn)行了分析，核苷酸和氨基酸序列比對(duì)結(jié)果顯示，與經(jīng)典毒株CV777相比，目前中國(guó)PEDV流行株已經(jīng)發(fā)生了變異。來(lái)自中國(guó)各地的10株P(guān)EDV流行株具有很高的同源性(98.2％～99.1％)，并與韓國(guó)強(qiáng)毒株DR13和中國(guó)早期毒株CH-S親緣關(guān)系較近，而與

3、經(jīng)典毒株CV777的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)(96.8％～97％)。PEDV中國(guó)流行株與參考毒株相比，各主要基因均發(fā)生了不同程度的變異，尤其以S基因突變最明顯，從而能夠在一定程度上解釋本病目前在豬群中普遍出現(xiàn)免疫失敗的原因。
　　S蛋白是位于PEDV病毒粒子表面的纖突蛋白，在病毒粒子與細(xì)胞表面受體結(jié)合后通過(guò)膜融合侵入宿主細(xì)胞的過(guò)程中發(fā)揮作用，并且能夠介導(dǎo)感染宿主體內(nèi)中和抗體的產(chǎn)生，是PEDV重要的結(jié)構(gòu)蛋白。為了逃避宿主免疫選擇的壓力，S基因極

4、易發(fā)生變異，因此常被用作評(píng)價(jià)PEDV的變異和基因工程疫苗的靶蛋白。使用MegAlign軟件對(duì)10個(gè)流行毒株和6個(gè)參考毒株的S基因序列分析后發(fā)現(xiàn)，流行株之間S基因的氨基酸序列同源性為97.3％-99.6％，而它們與經(jīng)典毒株CV777、中國(guó)早期分離株等參考毒株的核苷酸同源性僅為92.5％-94.6％。S基因氨基酸序列的變異主要集中在第27-374位氨基酸區(qū)域內(nèi)，其中在58-61位有連續(xù)4個(gè)氨基酸的插入，在143位有1個(gè)氨基酸的插入，在166

5、-169位有兩個(gè)氨基酸的缺失，此外還有多處連續(xù)或不連續(xù)的氨基酸改變。
　　根據(jù)序列比對(duì)結(jié)果，推測(cè)PEDV流行株S基因的變異可能導(dǎo)致其抗原性的改變。臨床上已免疫過(guò)CV777株疫苗的豬群依然發(fā)病，因此懷疑傳統(tǒng)的疫苗可能已經(jīng)無(wú)法為豬群提供有效保護(hù)。為此，作者克隆了PEDV CH/ZMDZY/11株S基因的高突變區(qū)，并通過(guò)原核表達(dá)系統(tǒng)成功獲得融合蛋白。Western Blot結(jié)果表明，該蛋白具有良好的反應(yīng)原性。本研究為PEDV變異毒株S基