豬流行性腹瀉病毒G1與G2基因亞型毒株抗原差異性分析.pdf

1、豬流行性腹瀉病毒（PEDV）是一種通過小腸感染，引起豬嘔吐、腹瀉、脫水的急性高度接觸性傳染病。2010年起在我國迅速爆發(fā)，對仔豬的致死率高達80％-100%。雖然弱毒疫苗與滅活疫苗對PEDV的流行起到一定的控制作用，但PEDV仍在我國廣泛存在，對養(yǎng)豬業(yè)造成重大經(jīng)濟損失。
　　PEDV可分為G1與G2基因亞型，兩亞型間可誘導機體產(chǎn)生中和抗體的病毒纖突(Spike, S)蛋白氨基酸序列存在缺失、插入和大量點突變。為進一步研究S蛋白序列

2、的變異是否造成病毒抗原性的差異，本課題選取PEDV G1亞型CV777疫苗株與G2亞型LNCT2流行株，對其S基因進行密碼子優(yōu)化，利用真核表達系統(tǒng)建立一種表達和純化重組S蛋白的方法。重組S蛋白免疫小鼠血清中IgG抗體水平顯著升高。用所制備抗S蛋白多克隆抗體(PAb)與不同亞型毒株進行間接酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）、間接免疫熒光(IFA)、Western blot、交叉中和試驗(SN)分析抗原差異性。ELISA結果顯示抗S蛋白PAb與

3、同型S蛋白反應效價可達1:204800，與不同型S蛋白反應效價為1:102400。IFA結果表明抗S蛋白PAb針對同型毒株反應產(chǎn)生熒光時抗體最大稀釋倍數(shù)為1:51200，針對不同型毒株反應產(chǎn)生熒光抗體最大稀釋倍數(shù)為1:25600。SN結果為抗CV777 S蛋白PAb中和CV777毒株的平均效價為1:336，交叉中和LNCT2毒株的效價為1:150；抗LNCT2 S蛋白PAb中和LNCT2毒株的平均效價為1:387，而交叉中和CV777毒

4、株的效價為1:230。結果表明不同亞型毒株間雖具有較強的交叉保護性，但PEDV S蛋白序列的變異使G1、G2亞型毒株產(chǎn)生了一定的抗原差異。
　　為進一步探究G1與G2亞型S蛋白產(chǎn)生抗原性差異的關鍵區(qū)域，本課題篩選出5株S蛋白單克隆抗體(Monoclonal antibody, MAb)，均可識別天然病毒中S蛋白。其中L5F7株MAb只與LNCT2毒株反應而不與CV777毒株反應，可用于鑒別G1與G2亞型毒株。利用截短表達蛋白方式初

5、步鑒定其表位區(qū)位于S蛋白N端1-234位氨基酸(aa)之間，為構象表位。通過對S蛋白氨基酸序列比對后發(fā)現(xiàn)，G1與G2亞型S蛋白在S1區(qū)21-402aa間高度變異，應用桿狀病毒表達系統(tǒng)表達CV777、LNCT2株S121-402aa蛋白并制備PAb，進行ELISA、IFA、SN等試驗，結果表明S121-402aa PAb與不同型毒株的反應效價差異不顯著，從而證明S121-402aa蛋白序列的高度變異并未產(chǎn)生明顯的抗原性差異。
　　本