豬流行性腹瀉抗原基因COE的原核表達(dá)與純化.pdf

1、豬流行性腹瀉病(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由猜流行性腹瀉病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus，PEDV)引發(fā)的一種腸道傳染病，自從該病在我國(guó)流行以來，給我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的經(jīng)濟(jì)損失。豬場(chǎng)主要通過日常消毒和接種疫苗來預(yù)防該病，但日前在市場(chǎng)上流行的疫苗并不能到達(dá)理想的免疫效果。研究表明仔豬主要通過初乳獲得母源SIgA（分泌型免疫球蛋白A）產(chǎn)生對(duì)PEDV的被動(dòng)免疫保護(hù)，血液中

2、循環(huán)的IgG抗體不能對(duì)仔豬產(chǎn)生有效的保護(hù)，非經(jīng)腸道黏膜免疫不能獲得SIgA，因此通過腸道黏膜免疫是使仔豬獲得免疫保護(hù)的重要途徑，研制安全有效可以通過腸道黏膜免疫的新型疫苗尤為重要。
　　S蛋白是由S基因編碼的PEDV一個(gè)表面結(jié)構(gòu)蛋白，電是PEDV的主要結(jié)構(gòu)蛋白，它含有介導(dǎo)病毒侵入宿主細(xì)胞的受體結(jié)合域，還含有介導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生病毒中和抗體的抗原表位。有可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生中和抗體和提供黏膜免疫保護(hù)的作用。COE抗原表位是S基因中的一個(gè)重要抗原

3、表位，是由chang等人發(fā)現(xiàn)并命名的，這個(gè)抗原表位位于S基因的499-638aa區(qū)域。自從COE抗原表位被發(fā)現(xiàn)后世界各國(guó)學(xué)者均嘗試應(yīng)用COE抗原表位基因研究制備PEDV的基因工程疫苗。
　　本實(shí)驗(yàn)是研究PEDV主要抗原決定簇COE的原核表達(dá)與純化，為研制新型的豬流行性腹瀉病毒疫苗奠定基礎(chǔ)。
　　本實(shí)驗(yàn)首先從河南本地的疑似得豬流行性腹瀉病的病豬小腸分離出PEDV，然后根據(jù)GenBank發(fā)表的PEDV-COE序列設(shè)計(jì)出一對(duì)引物，

4、用PCR的方法擴(kuò)增出長(zhǎng)度為420bp的COE目的片段。將目的片段連接在載體PMD19-T上，然后轉(zhuǎn)化到JM109大腸桿菌中，涂板過夜生長(zhǎng)，挑菌接種到液體LB中培養(yǎng)擴(kuò)增、提質(zhì)粒，鑒定正確后送公司測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果與GenBank公布的最相近的4個(gè)PEDV-COE序列做比較，發(fā)現(xiàn)河南本地PEDV發(fā)生了一定的突變，與河南周邊地區(qū)的毒株具有一定的差異。將COE基因片段連接至PET-32a載體上構(gòu)建原核表達(dá)載體PET-32a-COE，鑒定正確后將表

5、達(dá)載體轉(zhuǎn)化到BL21(DE3)pLysS大腸桿菌中。為了探索最佳的誘導(dǎo)條件，我們對(duì)IPTG誘導(dǎo)的濃度和時(shí)間進(jìn)行了優(yōu)化，結(jié)果顯示0.6mmol/L的IPTG誘導(dǎo)4h能夠得到最大量的目的蛋白。我們將誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白的大腸桿菌經(jīng)超聲破碎、經(jīng)鎳株蛋白純化試劑盒純化，透析復(fù)性，最后得到了HIS-COE目的蛋白。HIS-COE目的蛋白的成功表達(dá)與純化為制備能夠預(yù)防在本地區(qū)流行的PEDV的新型疫苗提供了參考，對(duì)PEDV基因工程疫苗的研究與制備也具有重