豬流行性腹瀉病毒S蛋白抗原表位鑒定及受體結(jié)合域的初步篩選.pdf

1、豬流行性腹瀉(porcineepidemicdiarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV)引起豬的一種急性、高度接觸性腸道傳染病。在過去30年間，雖然PEDV常規(guī)疫苗被廣泛應用，但是PED在各國豬場中的感染仍然非常嚴重，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。所以，關(guān)于PEDV的新型疫苗、侵入機制和免疫機理的研究是十分必要的。眾所周知，病毒的抗原表位、受體與受體結(jié)合域在病毒侵染和抗

2、病毒免疫中起著重要作用。S蛋白是PEDV一個表面的結(jié)構(gòu)蛋白，它既含有介導病毒侵入宿主細胞的受體結(jié)合域，又擁有介導機體產(chǎn)生病毒中和抗體的抗原表位。鑒于此，本研究對PEDVS蛋白的抗原表位和受體結(jié)合域進行篩選與鑒定，為PEDV診斷方法和新型疫苗的研究以及抗病毒免疫策略的設(shè)計提供信息。 為獲得PEDVS基因及其分子特性，本試驗克隆了PEDVCV777毒株細胞適應毒的S基因，序列比對結(jié)果表明，獲得的S基因與PEDVCV777毒株S基因參

3、考序列核苷酸的同原性為99.4％，推導氨基酸的同原性為99.8％。S蛋白氨基酸的疏水性、信號肽序列和N-側(cè)鏈連接糖基化位點分析表明，克隆的S基因保持了其親本毒株CV777S基因的分子特性。根據(jù)冠狀病毒Ⅱ群成員S蛋白S1和S2亞基之間的保守基序(GxCx和保守九肽)，PEDVS蛋白可以被劃分為2個功能區(qū)即S1(第1～789位氨基酸)和S2(第790～1383位氨基酸)，其中S1區(qū)包含了病毒主要的中和表位和受體結(jié)合域。 為了分析S蛋

4、白S1區(qū)抗原表位特征，利用fd絲狀噬菌體展示系統(tǒng)，構(gòu)建了S1基因特異性肽庫，以PEDV多克隆血清為靶蛋白對構(gòu)建的肽庫進行3輪生物淘選，結(jié)果獲得了3個高親和力序列，分別命名為S1P1(第248～280位氨基酸)、S1P2(第442～499位氨基酸)和S1P3(第697～742位氨基酸)。ELISA和Westernblot結(jié)果顯示，S1P1、S1P2和S1P3的GST融合蛋白均與PEDV多克隆血清反應，其中S1P3反應性最強。為了進一步揭示

5、S1P1、S1P2和S1P3短肽的抗原性，三個短肽GST融合蛋白和它們串聯(lián)后GST融合蛋白(S1P123-GST)的單因子鼠血清被制備。間接免疫熒光試驗(IFA)和ELISA結(jié)果證實，抗S1P2、S1P3和S1P123GST融合蛋白的單因子鼠血清能識別天然的PEDV。本試驗結(jié)果表明，S1P1、S1P2和S1P3是PEDVS蛋白3個線性抗原表位，S1P2和S1P3表位具有良好的免疫原性。 PEDVS蛋白S1區(qū)在介導中和抗體產(chǎn)生過程

6、中發(fā)揮重要作用。為了鑒定S蛋白S1區(qū)的免疫優(yōu)勢區(qū)，利用PCR擴增了4個相互重疊、覆蓋S1基因的片段，分別命名為S1A、S1B、S1C和S1D。四個片段PCR產(chǎn)物分別克隆到pGEX-6p-1原核表達載體后，經(jīng)IPTG誘導均獲得了表達。Westernblot和ELISA結(jié)果顯示，S1D-GST融合蛋白(第636～789位氨基酸)與PEDV的多克隆抗體具有強反應性。IFA和Westernblot結(jié)果表明，抗S1D-GST融合蛋白的鼠血清能夠識

7、別天然的S蛋白。病毒中和試驗表明，S1D-GST融合蛋白能介導鼠產(chǎn)生對PEDV具有中和作用的抗體。為了對中和表位區(qū)(S1D)的抗原表位進行精確定位，制備并獲得了6株抗S1D特異性的單克隆抗體，Westernblot結(jié)果顯示，6株單克隆抗體均能識別天然的S蛋白。利用噬菌體展示和肽掃描技術(shù)對6株單克隆抗體識別的表位進行了鑒定，結(jié)果顯示，單克隆抗體2C4、3C3和5F8識別的表位是S蛋白的第744～759位氨基酸(S1D5)，單克隆抗體3G3

8、、6E6和3G5識別的表位是S蛋白的第756～771位氨基酸(S1D6)。ELISA和IFA結(jié)果表明，抗S1D5和S1D6表位融合蛋白的鼠血清均能識別天然的S蛋白。進一步的肽掃描(Pepscan)結(jié)果顯示，S1D5表位的核心序列是Y748SNIGVCK755(SS5)，S1D6表位的核心序列是L764QDGQVKI771(SS6)。 病毒細胞受體和受體結(jié)合域的信息能為病毒疫苗和抗病毒藥物設(shè)計提供策略。為了揭示PEDV的受體結(jié)合域

9、信息，本試驗以PEDV可溶性的細胞受體豬氨基肽酶N(pAPN)為靶蛋白對S1基因特異性肽庫進行3輪生物淘選，然后對30個淘選的噬菌體克隆進行測序。序列分析發(fā)現(xiàn)，2個噬菌體克隆展示無義氨基酸序列，其余28個噬菌體克隆展示的氨基酸序列位于S蛋白第249～529位氨基酸區(qū)域，這個區(qū)域被命名為MRR。為了進一步印證MRR區(qū)與PAPN在體外的相互作用，利用Bac-to-Bac桿狀病毒表達系統(tǒng)對MRR基因進行真核表達。Westernblot結(jié)果表明

10、，表達的MRR重組蛋白能夠與兔抗PEDV的多克隆抗體反應。但是，進一步的pull-down實驗結(jié)果顯示，利用抗pAPN的鼠血清通過Westernblot檢測不到與MRR重組蛋白結(jié)合的pAPN。本試驗結(jié)果提示，PEDVS蛋白第249～529位氨基酸區(qū)域(MRR)是pAPN細胞受體的一個潛在的結(jié)合區(qū)域。 本研究鑒定出PEDVS蛋白5個線性抗原表位即S1P1(第248～280位氨基酸)、S1P2(第442～499位氨基酸)、S1P3(