豬流行性腹瀉病毒N蛋白單抗的制備及其模擬表位鑒定.pdf

1、豬流行性腹瀉(Porcine epidemic diarrhea，PED)是由豬流行性腹瀉病毒(Porcine epidemicdiarrhea virus，PEDV)引起的仔豬高致死率的高度接觸性腸道傳染病。目前，雖然商品化PEDV疫苗已普遍使用，但該病在我國仍有流行，并引起嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本病的流行病學(xué)特征和臨床癥狀與豬傳染性胃腸炎無明顯差別，在鑒別診斷與疫苗的應(yīng)用方面存在很大的困難，因此研制一種新型的有效的用于防治PEDV的疫苗以

2、及鑒別診斷方法具有實(shí)踐意義。
　　 抗原表位的研究在揭示抗原分子的結(jié)構(gòu)和功能、抗原抗體反應(yīng)機(jī)制方面具有重要意義，抗原表位的研究還可用于多肽疫苗和新型藥物的研發(fā)。噬菌體展示技術(shù)是一種廉價(jià)且快速的方法能夠鑒定與抗體有特殊反應(yīng)的抗原表位。20世紀(jì)80年代末，Stephen等研制了一種噬菌體載體系統(tǒng)。近年來，利用噬菌體載體系統(tǒng)制備的噬菌體隨機(jī)肽庫逐漸應(yīng)用于蛋白質(zhì)的抗原表位分析中。
　　 本研究通過RT-PCR克隆了PEDV N蛋

3、白的基因，構(gòu)建重組質(zhì)粒pET-30a-N。將重組質(zhì)粒pET-30a-N轉(zhuǎn)化到宿主表達(dá)菌Rosseta中，用終濃度為1mmol/L的IPTG對宿主表達(dá)菌誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)SDS-PAGE分析表達(dá)產(chǎn)物。結(jié)果表明N基因在原核表達(dá)系統(tǒng)pET-30a中獲得表達(dá)，表達(dá)的重組蛋白大小約為60KD。然后以PEDV-N蛋白為免疫原免疫小鼠，制備了4株抗PEDV的單克隆抗體。
　　 利用噬菌體隨機(jī)12肽庫對其中一株單抗3F8進(jìn)行4輪淘選，獲得了12個(gè)陽性

4、噬菌體克隆，測序結(jié)果顯示：11個(gè)噬菌體展示一致序列TPxxWxxYxxxxGP；與PEDV多株N蛋白氨基酸序列70-82氨基酸QPSNWHFYYLGTGP相似度很高；1個(gè)噬菌體展示序列DPGHRLLAWDRL，展示序列為HxxLxWDxx(x代表隨機(jī)氨基酸殘基)，與PEDV多株N蛋白氨基酸序列中414HANLEWD422有一定的同源性。噬菌體ELISA和抗原競爭抑制試驗(yàn)證實(shí)篩選到的噬菌體展示多肽的空間構(gòu)象與天然抗原表位相同或相似，可用于