犬博卡病毒GZHD15株全基因序列分析及PCR檢測(cè)方法的建立與應(yīng)用.pdf

1、博卡病毒是一種可感染多種動(dòng)物的小DNA病毒。近年來(lái)的研究逐步增多，主要是針對(duì)人博卡病毒（HBoV）、豬博卡病毒（PBoV）、牛博卡病毒（BPV）的檢測(cè)方法、基因分型、細(xì)胞培養(yǎng)技術(shù)、致病性等方面的研究。但基因型復(fù)雜、檢測(cè)方法滯后、致病機(jī)制報(bào)道很少，嚴(yán)重限制博卡病毒流行調(diào)查、防控技術(shù)儲(chǔ)備，尤其是犬博卡病毒(CBoVs)的研究相對(duì)較少。因此，本課題對(duì)實(shí)驗(yàn)室保存的犬博卡病毒株GZHD15進(jìn)行全基因序列分析，并建立PCR檢測(cè)方法。初步掌握了CBo

2、Vs在國(guó)內(nèi)地區(qū)性的流行情況，對(duì)提高檢測(cè)水平及CBoVs更深層次的研究提供基礎(chǔ)的科學(xué)數(shù)據(jù)資料和思路，具有科學(xué)價(jià)值和意義。
　　本課題選擇實(shí)驗(yàn)室保存的犬博卡病毒株GZHD15，對(duì)其進(jìn)行分段擴(kuò)增全基因組，再全基因組克隆，對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，獲得一條全長(zhǎng)5116bp的基因序列，將其與NCBI中的所有完整的CBoVs基因序列和其它博卡病毒部分完整基因序列構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)，經(jīng)分析發(fā)現(xiàn)GZHD15株與CBoV2的親緣關(guān)系最近，在CBoV2中，GZHD

3、15株與香港株（登錄號(hào)：JQ692588-JQ692590）和韓國(guó)株（登錄號(hào)：KP281717）親緣關(guān)系最近。運(yùn)用NCBI中的在線軟件對(duì)其進(jìn)行開(kāi)放閱讀框（Open reading frame, ORF）預(yù)測(cè)，GZHD15株同其它CBOVs一樣，共3個(gè)ORF，分別編碼非結(jié)構(gòu)蛋白NS1、NP1，結(jié)構(gòu)蛋白VPI、VP2。在與NCBI中25條完整CBoVs基因全長(zhǎng)比對(duì)中，GZHD15株與15株CBoV2的核苷酸同源性在92.6％-96.8%，與

4、MVC同源性普遍低于61.2%，與CBoV3同源性55.7%。與26條CBoVs基因序列的病毒蛋白NS1、NP1、VP1、VP2進(jìn)行核苷酸和氨基酸同源性對(duì)比，結(jié)果和整體基因序列的比對(duì)結(jié)果保持一致。
　　參考CBoVs結(jié)構(gòu)蛋白VP2的基因序列，用引物設(shè)計(jì)軟件Primer premier5.0設(shè)計(jì)一對(duì)檢測(cè)引物，建立PCR檢測(cè)方法，分別從退火溫度、引物用量?jī)煞矫鎸?duì)檢測(cè)方法進(jìn)行優(yōu)化，并通過(guò)特異性實(shí)驗(yàn)、敏感性實(shí)驗(yàn)、重復(fù)性實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證優(yōu)化后的檢測(cè)