豬偽狂犬病病毒、豬乙型腦炎病毒LAMP檢測(cè)方法的建立.pdf

1、偽狂犬?。≒seudorabies, PR）是甲型皰疹病毒亞科的一個(gè)成員，可導(dǎo)致多種家畜和野生動(dòng)物出現(xiàn)發(fā)熱、瘙癢和腦脊髓炎等癥狀的急性傳染病。乙型腦炎病是由乙型腦炎病毒（Epidemic encephalitisvirus）引起的一種重要的蚊媒性人獸共患傳染病，多種動(dòng)物易感。這兩種病毒均引起懷孕母豬流產(chǎn)、產(chǎn)死胎兒或者木乃伊胎，公豬出現(xiàn)睪丸炎或不育，給養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展造成了巨大的危害和經(jīng)濟(jì)損失。目前常用的診斷方法有以下幾種：病毒的分離鑒定、酶

2、聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)、中和試驗(yàn)、聚合酶鏈反應(yīng)等。雖然這些方法在實(shí)際生產(chǎn)中發(fā)揮了巨大的作用，但存在操作繁雜、費(fèi)時(shí)費(fèi)力、費(fèi)用較高、靈敏性低，同時(shí)需要貴重的儀器設(shè)備等不足。本研究的目的是建立一種簡(jiǎn)便快速、靈敏性高、特異性強(qiáng)的檢測(cè)方法。
　　本研究采用 LAMP技術(shù)利用 PRV DBP基因的一段序列設(shè)計(jì)了6條 LAMP引物，建立了 PRV-LAMP檢測(cè)方法。反應(yīng)體系是：10×Thermopol反應(yīng)緩沖液2.5μL，dNTP（10mmol/L）2

3、.0μL，Mg2+（50mmol/L）1.5μL，混合引物（FIP、BIP：40μmol/L；F3、B3：20μmol/L；LF、LB：5μmol/L；將稀釋好的引物等量混合）6.0μL，BstDNA聚合酶（8U）1.0μL，模板DNA2.0μL，加滅菌雙蒸水10.0μL。利用JEV的prM protein編碼序列設(shè)計(jì)6條LAMP引物，建立了JEV-LAMP檢測(cè)方法。反應(yīng)體系是：10×Thermopol反應(yīng)緩沖液2.5μL， dNTP（

4、10mmol/L）2.5μL， Mg2+（50mmol/L）2.0μL，混合引物（ FIP、BIP：40μmol/L；F3、B3：20μmol/L；LF、LB：5μmol/L；將稀釋好的引物等量混合）6.0μL，Bst DNA聚合酶（8U）1.0μL，模板cDNA2.0μL，加滅菌雙蒸水9.0μL。
　　本論文建立了 PRV-LAMP和 JEV-LAMP兩種檢測(cè)方法。PRV-LAMP在63℃恒溫條件下擴(kuò)增40min可得到最佳結(jié)果，

5、靈敏性比 PCR方法高100倍，且特異性好，對(duì)豬乙型腦炎病毒、圓環(huán)病毒Ⅱ型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒、豬瘟病毒沒(méi)有交叉反應(yīng)。JEV-LAMP在61℃恒溫條件下擴(kuò)增50min得到最佳結(jié)果，靈敏性比PCR方法高10倍，與豬偽狂犬病毒、豬圓環(huán)病毒Ⅱ型、豬繁殖與呼吸綜合征病毒均沒(méi)有交叉反應(yīng)，特異性好。兩種 LAMP檢測(cè)方法與羅丹明 B衍生物熒光染料相結(jié)合產(chǎn)生了可視性檢測(cè)，擴(kuò)增結(jié)束后可直接根據(jù)顏色變化判定結(jié)果：藍(lán)色為陽(yáng)性，紫色為陰性。建立的 LAM