應(yīng)用豬口腔液拭子監(jiān)控偽狂犬病病毒感染.pdf

1、口腔液診斷疾病方法是一種通過(guò)檢測(cè)機(jī)體口腔液中病原或特異性抗體來(lái)診斷疾病的一種技術(shù)。在20世紀(jì)80年代中期，研究人員利用口腔液檢測(cè)到艾滋病毒（HIV），隨后該技術(shù)得到了迅速的發(fā)展，并擴(kuò)展到豬病診斷領(lǐng)域。到目前為止，應(yīng)用豬口腔液可以檢測(cè)的病原有非洲豬瘟病毒（ASFV）、經(jīng)典豬瘟病毒（CSFV）和豬圓環(huán)病毒2型（PCV2）等病毒，但是未見(jiàn)用于檢測(cè)偽狂犬病病毒的報(bào)道。
　　偽狂犬?。≒seudorabies，PR或Aujeszky’s d

2、isease，AD）是一種由偽狂犬病病毒（Pseudorabies virus，PRV）感染引起的多種家畜和野生動(dòng)物共患的急性、熱性傳染病，嚴(yán)重危害我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。目前對(duì)豬群 PRV感染的監(jiān)控都是通過(guò)活體采集扁桃體或血液分離血清，操作費(fèi)時(shí)費(fèi)力，且對(duì)動(dòng)物應(yīng)激較大。為此，本研究嘗試建立通過(guò)采集和檢測(cè)口腔液中偽狂犬病病毒的方法，并與傳統(tǒng)采樣方法相比較，為臨床監(jiān)控該病毒提供便利方法。主要研究?jī)?nèi)容如下：
　　1.口腔液收集材料的選擇

3、>　　用不同材質(zhì)和規(guī)格的繩子供豬啃咬，在 DMEM培養(yǎng)基中分別浸泡5~30min，結(jié)果顯示棉繩經(jīng)受豬啃咬的時(shí)間最長(zhǎng)，直徑為1.0cm的棉繩在吸附20~30min后，吸附DMEM量最大。
　　2．棉繩吸附病毒能力評(píng)估和檢測(cè)方法的建立
　　滅菌棉繩分別放入經(jīng)過(guò)10倍梯度稀釋的PRV液中，吸附30min，提取各梯度的病毒液和棉繩吸附液中 PRV DNA，并分別經(jīng)常規(guī) PCR方法和熒光定量 PCR方法檢測(cè)，同時(shí)將病毒液和棉繩吸附液冷

4、藏（4~8℃）0~24 h后，提取DNA進(jìn)行常規(guī) PCR方法檢測(cè)。結(jié)果顯示，病毒液與棉繩吸附液經(jīng)常規(guī) PCR方法能檢測(cè)出最小病毒量分別為102TCID50/0.1mL和103TCID50/0.1mL；熒光定量 PCR方法能檢測(cè)出各梯度病毒液和棉繩吸附液中最小檢出量每微升病毒 DNA相對(duì)拷貝數(shù)分別為：8.113、7.034、6.380、5.410、4.250、4.039、3.529、2.877和7.739、6.759、6.021、5.22

5、4、3.793、3.729、3.284、2.763；冷藏0h、6h、12h、18h和24 h后，病毒液與棉繩吸附液能檢測(cè)出最小病毒量分別為102TCID50/0.1mL和103TCID50/0.1mL。結(jié)果表明，棉繩吸附液中檢出的病原含量略低于病毒液，病毒液與棉繩吸附液在冷藏24 h內(nèi)，不影響檢測(cè)敏感性。
　　3.人工感染仔豬口腔液中PRV的檢測(cè)
　　將 PRV gB抗體陰性仔豬分別接種 PRV-HNX或 DMEM，隨后用常

6、規(guī) PCR方法分別檢測(cè)每天采集的口腔液拭子樣品，用熒光定量 PCR方法分別檢測(cè)每天采集的口腔液拭子和鼻拭子樣品，同時(shí)檢測(cè)1~14d，21d，28d血清中 gB和 gE抗體。結(jié)果顯示，常規(guī) PCR方法和熒光定量 PCR方法都能在 PRV-HNX株接種后1~28d采集的口腔液拭子樣品中檢測(cè)PRV存在，而接種DMEM的仔豬的口腔液拭子樣品中均未檢測(cè)出PRV；仔豬感染PRV-HNX株后1~28d，其口腔液拭子比鼻拭子樣品會(huì)有更高的PRV基因組拷

7、貝數(shù)；PRV gB抗體陰性仔豬接種 PRV-HNX株7d后，仔豬血清中PRV gB和gE抗體都轉(zhuǎn)陽(yáng)。結(jié)果表明，本研究建立的PCR方法能監(jiān)控PRV感染后在仔豬的口腔液中排毒，且口腔液拭子中 PRV的病毒含量高于鼻拭子，豬群感染PRV后，口腔液中排毒時(shí)間早于血清中抗體轉(zhuǎn)陽(yáng)時(shí)間。
　　4.臨床應(yīng)用
　　從8個(gè)規(guī)?；i場(chǎng)采集的148份豬口腔液拭子中，檢出PRV陽(yáng)性80份，陽(yáng)性率為54.05％，而對(duì)應(yīng)豬的血清中 PRV gB和 gE抗