豬偽狂犬病病毒細(xì)菌人工染色體的構(gòu)建.pdf

1、偽狂犬病(Pseudorabies，PR)是由偽狂犬病病毒(Pseudorabies virus，PRV)感染引起的一種能在大多數(shù)哺乳動物中傳播的急性傳染病。豬為PRV的天然宿主和儲存宿主，其臨床癥狀主要表現(xiàn)為仔豬神經(jīng)癥狀、妊娠母豬流產(chǎn)、死胎。該病曾在世界范圍內(nèi)流行，給各國養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。自上世紀(jì)80年代起，我國大部分豬場通過免疫Bartha-K61疫苗使該病得到有效控制。但自2011年下半年以來，在我國河南、黑龍江和江蘇等

2、多個省市出現(xiàn)了PRV變異株，其基因組與以往PRV毒株相比存在多處插入或缺失，基因型屬于Ⅱ型，給養(yǎng)豬業(yè)造成了重大的損失。
　　PRV基因組十分龐大，全長約142 kb，對其基因進(jìn)行改造和修飾十分困難。傳統(tǒng)同源重組方法獲得重組病毒效率較低、花費時間長，而利用細(xì)菌人工染色體(Bacterial Artificial Chromosome，BAC)構(gòu)建的感染性克隆便于在細(xì)菌中對PRV龐大的基因組進(jìn)行基因的缺失、插入或突變。本研究先將綠色熒

3、光蛋白(GFP)表達(dá)盒插入到pBACloxp載體中，得到pBAC-GFP;再將PRV變異株P(guān)RVHLJ8的Us4-Us6和Us2-Us1基因片段作為同源臂，分別克隆到pBAC-GFP載體中，得到中間轉(zhuǎn)移載體pBAC-GFP62;然后將線性化中間轉(zhuǎn)移載體與PRV HLJ8基因組共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞，獲得攜帶pBAC載體的PRV重組毒vBAC-HLJ8。提取vBAC-HLJ8環(huán)化基因組并電轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH10B中，利用PCR方法篩選陽性BA

4、C克隆后，轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞獲得了resBAC-HLJ8。病毒增殖曲線顯示resBAC-HLJ8與PRVHLJ8相比，復(fù)制變慢。病毒拯救表明成功構(gòu)建了PRV變異株HLJ8的細(xì)菌人工染色體。利用同樣的方法，成功構(gòu)建了PRV弱毒疫苗株Bartha-K61的細(xì)菌人工染色體。
　　為提高重組病毒的篩選效率，本研究將中間轉(zhuǎn)移載體、PRV HLJ8基因組和pCas9質(zhì)粒（含有針對同源臂或同源臂內(nèi)側(cè)基因的gRNA）共轉(zhuǎn)染Vero細(xì)胞。研究發(fā)現(xiàn)用單

5、一gRNA切割同源臂內(nèi)側(cè)基因，或兩個gRNAs同時切割同源臂內(nèi)側(cè)基因，都能有效提高重組病毒的產(chǎn)率。尤其是雙gRNA切割，能高效地促進(jìn)BAC載體的插入。
　　PRV變異株HLJ8、PRV弱毒疫苗株Bartha-K61細(xì)菌人工染色體的成功構(gòu)建，為今后對PRV基因組進(jìn)行快速、準(zhǔn)確修飾奠定基礎(chǔ)。同時，利用CRISPR/Cas9技術(shù)切割基因能有效提高重組效率，大大縮短獲得BAC重組病毒的時間。這一發(fā)現(xiàn)同時也為其他DNA病毒的重組體的構(gòu)建提供