Cre-loxP系統(tǒng)在重組偽狂犬病病毒中的應(yīng)用.pdf

1、　　偽狂犬病(Pseudorabies)又稱Aujeszky氏病，是由皰疹病毒科(Herpesviridae)α亞科中的豬皰疹病毒Ⅰ型(suidherpesvirusⅠ)所引起的豬、牛、羊等多種家畜及野生動(dòng)物的一種以發(fā)熱、奇癢(除豬外)、腦脊髓炎為主要癥狀的急性傳染病。世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)將其列為B類傳染病。豬是該病的主要貯存宿主和傳染源，對養(yǎng)豬業(yè)造成的經(jīng)濟(jì)損失僅次于豬瘟和口蹄疫。偽狂犬病病毒上海株(PRVSH)是從上海地區(qū)某豬場

2、發(fā)病豬中分離的一株地方毒株，與強(qiáng)毒株Ea株具有相似的特性。經(jīng)過對PRVSH株TK基因序列分析發(fā)現(xiàn)，PRVSH株TK基因與我國的地方分離株Ea株和Fa株的基因同源性及推導(dǎo)的氨基酸同源性都很高，所以選擇PRVSH株為親本毒株在我國具有一定的實(shí)用價(jià)值?！　re/loxP位點(diǎn)特異性重組系統(tǒng)具有位點(diǎn)特異、時(shí)期特異、組織特異和高效重組的特點(diǎn)，可廣泛用于細(xì)菌、真菌、植物、昆蟲和哺乳動(dòng)物的體內(nèi)、體外基因重組。Cre和loxP均來自于P1噬菌體，其介

3、導(dǎo)的基因重組不需要其他蛋白質(zhì)或輔助因子參與，僅需納摩爾的量即可與loxP位點(diǎn)結(jié)合，完成體內(nèi)或體外的DNA的重組，將外源基因定點(diǎn)整合到染色體上或?qū)⑻囟ǖ腄NA片段刪除；Cre/loxP重組系統(tǒng)在基因靶位操作、基因功能地鑒定、外源基因的整合等方面得到了有效的利用，在轉(zhuǎn)基因的酵母、植物、昆蟲、哺乳動(dòng)物的體內(nèi)外DNA重組方面成為一個(gè)有力的工具。根據(jù)GenBank已發(fā)表的pEGFP-C1序列，設(shè)計(jì)并合成兩對引物，PCR擴(kuò)增出兩端各含一同向loxP

4、位點(diǎn)的GFP表達(dá)盒GFP-loxP?？寺∮谳d體pSKLR獲得轉(zhuǎn)移載體pSKLR-GFP-loxP；提取轉(zhuǎn)移載體質(zhì)粒，經(jīng)聚乙二醇純化后，用磷酸鈣轉(zhuǎn)染法與PRVSH株共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，在5-溴脫氧尿嘧啶(BrdU)的篩選壓力下，利用蝕斑法TK-143細(xì)胞篩選出含綠色熒光的TK基因缺失的重組毒株，命名為rPRV1；以此重組毒株為親本毒，共轉(zhuǎn)染表達(dá)Cre酶的質(zhì)粒POG231，在Cre酶的作用下去除GFP表達(dá)盒以及一個(gè)loxP位點(diǎn)，以蝕斑法得到