帶BAC質(zhì)粒的重組偽狂犬病病毒的構(gòu)建及其體外生長特性研究.pdf

1、偽狂犬?。≒seudoeabies，PRV）又稱Aujeszky氏病，是由皰疹病毒科（Herpesviridae）α亞科中的豬皰疹病毒Ⅰ（suiderpesvirusⅠ）所引起的豬、牛、羊等多種家畜及野生動(dòng)物的一種以發(fā)熱、奇癢（除豬外）、腦脊髓炎為主要癥狀的急性傳染病。尤其是豬偽狂犬病，給世界養(yǎng)豬業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。偽狂犬病毒基因組全長約150kb，可編碼70～100種蛋白，與α-皰疹病毒亞科的其它成員一樣，PRV具有潛伏感染和神經(jīng)

2、嗜性等α-皰疹病毒的典型特征。
　　 長期以來，基因缺失突變株的構(gòu)建是研究皰疹病毒功能基因的主要策略，但在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中通過同源重組的方法構(gòu)建基因缺失突變株是一項(xiàng)極為繁瑣的工作。1997年，德國學(xué)者M(jìn)esserle等首次以細(xì)菌人工染色體（Bacterial Artificial Chromosomes，BAC）為基礎(chǔ)構(gòu)建了鼠巨細(xì)胞病毒的感染性克隆。該技術(shù)允許病毒基因組以BAC質(zhì)粒的形式在大腸桿菌中保存、增殖和遺傳修飾，并且操作簡

3、便、快速，極大地促進(jìn)了皰疹病毒的功能基因研究，并為皰疹病毒高效載體系統(tǒng)的開發(fā)提供了新的途徑。
　　 本研究通過基因克隆技術(shù)以PRV弱毒疫苗株Bartha K61株的部分TK基因作為同源臂，以及綠色熒光蛋白基因（EGFP）作為篩選標(biāo)記構(gòu)建了帶loxP位點(diǎn)的pUCTKAB-EGFP質(zhì)粒，然后將pBeloBAC11線性化后插入到pUCTKAB-EGFP中構(gòu)建了轉(zhuǎn)移載體pUCTK-EGFP-BAC11。將PRV基因組和轉(zhuǎn)移載體共轉(zhuǎn)染Ve

4、ro細(xì)胞，利用同源重組在Bartha K61株的TK基因中插入了BAC質(zhì)粒和綠色熒光蛋白篩選標(biāo)記，經(jīng)過11輪噬斑純化和鑒定證實(shí)獲得了帶BAC質(zhì)粒的重組偽狂犬病毒rv-PRVBAC。通過噬斑試驗(yàn)和一步生長曲線測定等方法對(duì)重組偽狂犬病毒rv-PRVBAC的生長特性進(jìn)行研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)帶有BAC質(zhì)粒及篩選標(biāo)記的重組病毒rv-PRVBAC在體外細(xì)胞培養(yǎng)中的增殖速度與親本毒Bartha K61株相比沒有明顯差別，說明大的基因片段的插入沒有影響重組病