利用Cre-loxP自動敲除AIV H5 HA重組雞痘病毒中的報告基因.pdf

1、本研究利用Cre-loxp系統(tǒng)去除了重組毒的報告基因，最終獲得了只含表達禽流感病毒(AIV)H5亞型血凝素(HA)基因的重組雞痘病毒，并對其進行了初步的免疫效力測定。主要研究內(nèi)容如下： 1.禽痘病毒通用轉(zhuǎn)移載體的構(gòu)建 以禽痘病毒(FPV)282E4株基因組DNA為模板，PCR擴增了2.35kb大小的禽痘病毒F30序列作為同源重組臂。將含痘病毒早晚期啟動子的綠色熒光蛋白基因插入F30序列基因構(gòu)建轉(zhuǎn)移載體，通過首次轉(zhuǎn)染、篩選

2、，獲得了表達GFP的重組禽痘病毒。二次轉(zhuǎn)染過程中通過Cre重組酶，去除了重組病毒基因組的GFP基因，達到了去除報告基因的目的。實驗結(jié)果表明，以GFP作為篩選標記使重組病毒的純化更為簡便，同時利用Cre-loxP系統(tǒng)可以輕松地去除報告基因，為目的基因重組禽痘病毒的構(gòu)建創(chuàng)造條件。 2.表達禽流感病毒H5血凝素重組禽痘病毒的構(gòu)建 以含HA基因pH308為模板，通過PCR擴增了H5亞型禽流感病毒HA基因，構(gòu)建含禽痘病毒復合啟動子

3、、SV40PolyA的H5HA基因表達盒。將H5血凝素基因和GFP基因表達盒克隆入禽痘病毒F30基因構(gòu)建了轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體pPH5，將轉(zhuǎn)移質(zhì)粒載體與脂質(zhì)體混合轉(zhuǎn)染已感染FPV282E4株的CEF細胞，利用免疫熒光初次篩選了表達H5和GFP的禽痘病毒重組體。通過二次轉(zhuǎn)染，利用Cre-Loxp系統(tǒng)自動敲除重組病毒中的GFP基因，最終獲得了只含H5血凝素基因表達盒的重組禽痘病毒。免疫熒光和病毒復制效率測定結(jié)果表明，經(jīng)過6次傳代后重組病毒仍然穩(wěn)定復