不同插入位點(diǎn)表達(dá)H5亞型AIV HA基因重組雞痘病毒的構(gòu)建及免疫效力的比較研究.pdf

1、H5亞型禽流感(AI)給我國(guó)的養(yǎng)禽業(yè)造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失，而疫苗免疫是防控該病的重要手段。血凝素(HA)是禽流感病毒(AIV)誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生中和抗體最重要的保護(hù)性抗原，然而HA基因容易發(fā)生突變，導(dǎo)致近年來(lái)我國(guó)H5亞型AIV出現(xiàn)多個(gè)流行分支，因此開(kāi)發(fā)免疫效果好的多價(jià)H5亞型禽流感疫苗對(duì)于有效防控該病具有重要意義。雞痘病毒(FPV)具有多個(gè)復(fù)制非必需區(qū)，是構(gòu)建表達(dá)H5亞型不同分支HA基因重組疫苗的理想載體。目前，雖然同一復(fù)制非必需區(qū)插入多個(gè)H

2、A的重組雞痘疫苗已有報(bào)道，但該型疫苗免疫效果的提高仍然有限。我們也可在不同復(fù)制非必需區(qū)插入不同的HA基因構(gòu)建多價(jià)疫苗，而復(fù)制非必需區(qū)的篩選可能是影響重組雞痘疫苗免疫效果的關(guān)鍵。因此，本研究構(gòu)建了復(fù)制非必需區(qū)(FPV34)表達(dá)HA基因的重組雞痘疫苗，并與其它插入位點(diǎn)(FPV12)的重組雞痘病毒進(jìn)行了生長(zhǎng)特性、HA轉(zhuǎn)錄及蛋白表達(dá)水平以及免疫效力的比較研究，旨在為多價(jià)H5亞型禽流感重組雞痘疫苗的研制奠定一定的基礎(chǔ)。
　　1、表達(dá)H5亞型

3、AIV HA基因重組雞痘病毒的構(gòu)建
　　將PCR擴(kuò)增的雞痘病毒復(fù)制非必需區(qū)片段FPV3和FPV4克隆至pBluescript SK(-)載體，得到載體pSKP3P4;然后將從質(zhì)粒pFG1175-1酶切下來(lái)的標(biāo)記基因表達(dá)框P11-LacZ和從質(zhì)粒P12LS酶切下來(lái)的啟動(dòng)子Ps分別克隆至載體pSKP3P4，得到轉(zhuǎn)移載體p34xLs;最后將H5亞型AIV SY株(clade2.3.4)和W6-7株(clade7.2)的HA基因分別插入轉(zhuǎn)

4、移載體p34xLS中Ps啟動(dòng)子下游，獲得轉(zhuǎn)移載體p34xLs-SYHA和p34xLs-W6-7HA。用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染已感染FPV的CEF，利用藍(lán)白斑篩選獲得純化的表達(dá)HA基因的重組雞痘病毒rFPV34-SYHA和rFPV34-W6-7HA。提取重組病毒的基因組DNA，分別擴(kuò)增HA基因，證明目的基因成功插入雞痘病毒基因組;免疫熒光試驗(yàn)表明HA基因能夠在重組雞痘病毒中正確表達(dá)。
　　2、不同插入位點(diǎn)重組雞痘病毒的生長(zhǎng)特性、HA轉(zhuǎn)錄和蛋白

5、表達(dá)水平的比較
　　重組雞痘病毒rFPV12-SYHA和rFPV34-SYHA分別感染雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)，首先測(cè)定各病毒的效價(jià)及生長(zhǎng)曲線。其次，運(yùn)用相對(duì)熒光定量PCR的方法檢測(cè)以上兩株重組病毒HA基因在CEF細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄水平。最后，采用ELISA比較重組病毒外源基因的蛋白表達(dá)水平。生長(zhǎng)曲線的結(jié)果表明兩株重組病毒rFPV12-SYHA和rFPV34-SYHA在生長(zhǎng)特性方面類似;相對(duì)熒光定量PCR的結(jié)果表明了它們?cè)贖A基因轉(zhuǎn)錄水

6、平方面沒(méi)有顯著差異;ELISA數(shù)據(jù)則證明了rFPV12-SYHA和rFPV34-SYHA在表達(dá)HA蛋白方面沒(méi)有顯著差異。
　　3、表達(dá)H5亞型AIV HA基因重組雞痘病毒免疫效力試驗(yàn)
　　10日齡SPF雞隨機(jī)分組，分別免疫rFPV12-SYHA、rFPV34-SYHA、rFPV34-W6-7HA和wt-FPVLP，劑量為105 PFU/只，同時(shí)設(shè)H5亞型AI油乳劑滅活苗對(duì)照組和PBS對(duì)照組，劑量為0.2 mL/只。在免疫后7

7、d、10d、14d、17d和21 d分別采集外周血，檢測(cè)HI抗體效價(jià)。結(jié)果顯示，各重組病毒均能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生一定水平的HI抗體，但均顯著低于滅活油苗組(P＜0.05)。免疫后21d，分別用相應(yīng)的母本SY株和W6-7株進(jìn)行攻毒，攻毒劑量均為105 EID50，隨后觀察各疫苗對(duì)雞的免疫保護(hù)效果，采集喉拭子和泄殖腔拭子并測(cè)定排毒情況。結(jié)果表明，針對(duì)AIV SY株攻擊，rFPV12-SYHA和rFPV34-SYHA免疫組的攻毒保護(hù)率為85％，而免疫