共表達(dá)AIV HA（H5）和NDV HN或NDV F和HN的兩種重組雞痘病毒的構(gòu)建與免疫效力.pdf

1、新城疫、高致病性禽流感是嚴(yán)重威脅我國養(yǎng)禽業(yè)發(fā)展及公共安全的的二種重要傳染病，免疫接種是預(yù)防這兩種傳染病的主要措施。為克服常規(guī)疫苗的不足，研制新一代安全高效、使用方便的基因工程疫苗，我們利用新型轉(zhuǎn)移載體pP12LS，分別構(gòu)建了共表達(dá)．AIV H5A和NDV HN基因及共表達(dá)NDV F和HN基因的兩種重組雞痘病毒，并對其免疫效力進(jìn)行評估，主要內(nèi)容如下： 1.表達(dá)NDV F基因和H5亞型AIV HA基因的重組雞痘病毒的構(gòu)建首先將轉(zhuǎn)移載

2、體pPE/LNA用Sma I+Not I進(jìn)行雙酶切，回收包含啟動子PE/L的載體片段pPE/L，；同時將質(zhì)粒pTH5Am用Sma I+Not I進(jìn)行雙酶切，回收HAm基因片段，將HAm片段和載體片段pPE/L連接，得中間轉(zhuǎn)移載體pPE/LHAm。將pPE/LHAm用HindⅢ酶切，回收約1.8Kb的含有PE/L啟動子的HAm片段，與經(jīng)HindⅢ酶切回收的線性載體pPl2LSHN進(jìn)行連接，得到H5A和HN基因的啟動子分別為PE/L和Ps，

3、且兩基因盒方向為背向串聯(lián)的重組轉(zhuǎn)移載體pP13LSH5AHN。將pPl2LSHAHN轉(zhuǎn)染至已預(yù)先感染雞痘病毒大空斑株(LP-FPV)的雞胚成纖維細(xì)胞(CEF)中，pPl2LSHAHN與LP-FPV基因組DNA之間的同源重組產(chǎn)生了重組雞痘病毒rFPV-12LSHAHN，通過在含X．Gal的營養(yǎng)瓊脂上連續(xù)挑選藍(lán)色病毒蝕斑，獲得純化的重組病毒，間接熒光試驗結(jié)果表明HA和HN在細(xì)胞中均得到很好表達(dá)。經(jīng)傳代證實該重組病毒具有良好的遺傳穩(wěn)定性，與親

4、本毒相比，重組病毒在病毒的復(fù)制和致雞胚成纖維細(xì)胞的病變方面無顯著不同，生長速度也未發(fā)生顯著改變。 2.表達(dá)NDVF基因和HN基因的重組雞痘病毒的構(gòu)建將近年來鵝源新城疫流行強(qiáng)毒株ZJ1的F和FIN基因插入新型轉(zhuǎn)移載體pP12LS中。F和HN基因的啟動子分別為PE/L和Ps，獲得用不同的啟動子啟動不同的外源基因且兩基因盒方向為背向串聯(lián)的轉(zhuǎn)移載體pPl2LSFHN，通過和親本病毒LP-FPV基因組DNA之間的同源重組獲得了重組雞痘病毒

5、rFPV-12LSFHN：通過藍(lán)斑篩選獲得純化病毒，間接熒光試驗結(jié)果表明F和HN在細(xì)胞中均得到很好表達(dá)。與親本病毒相比，重組病毒的空斑形成明顯的合胞體，之前未見報道。而單表達(dá)新城疫病毒F基因的重組病毒rFPV-12LSF和單表達(dá)新城疫病毒HN基因的重組病毒ffPV-12LSHN都未出現(xiàn)感染細(xì)胞發(fā)生融合的特征，可能是由于rFPV-12LSFHN中F和HN蛋白同時并準(zhǔn)確表達(dá)造成的，也可能和ZJ1株新城疫病毒F蛋白的強(qiáng)融合能力有關(guān)。此外，重組

6、病毒的生長速率有較顯著提高，并且能夠達(dá)到比親本病毒更高的病毒滴度，可能是由于融合作用加速了對鄰近細(xì)胞的感染進(jìn)程，此特性為疫苗生產(chǎn)提供了有利條件。同時，本實驗也進(jìn)一步證明了F蛋白的融合作用必須有HN的協(xié)助才能完成。 3.rFPV-12LSHAHN和rFPV-12LSFHN的免疫效力檢測。 3.1 ffPV-12LSHAHN和ffPV-12LSFHN在SPF雞上的免疫效力檢測。 3.1.1 SPF雞免疫ffPV-12

7、LSHAHN后抵抗SY株AIV攻擊的免疫保護(hù)作用將1日齡SPF雞隨機(jī)分為3組，8只/組，隔離飼養(yǎng)。于14日齡分別于頸部皮下接種重組病毒rFPV-12L,SHAHN、LP-FPV，2×104PFU/只，同時設(shè)H5 AIV油苗對照組，頸部皮下接種，0.2mL/只。免疫后21d，使用SY株H5 AIV，通過滴鼻點眼途徑，以5×104 ELD50/羽的劑量對各組雞進(jìn)行攻毒。攻毒后連續(xù)觀察14天，統(tǒng)計發(fā)病死亡情況，并于攻毒后第4天和第14天采集試

8、驗雞的氣管和泄殖腔棉拭子，接種10日齡SPF雞胚作病毒分離試驗。結(jié)果表明除LP-FPV組全部死亡外，其余各組均能完全抵抗SYH5 AIV的攻擊；rFPV-12LSHAHN與H5 AIV油苗免疫組在排毒方面也無顯著差別。 所有試驗雞分別在免疫后7d、14d、21d采血，分離血清，用HI試驗測定血清中的抗體效價。 3.1.2 SPF雞免疫rfPV-12LSHAHN或rFPV-12LSFHN后抵抗F48E8株NDV攻擊的免疫保

9、護(hù)作用將1日齡SPF雞隨機(jī)分為4組，8只/組，隔離飼養(yǎng)。10日齡時，于頸部皮下分別接種重組病毒rFPV-12LSHAHN、rFPV-12LSFHN、LP-FPV，2×104PFU/只，同時設(shè)ZJ1株NDV油苗對照組，頸部皮下接種，0.2mL/只。免疫后21d，每只試驗雞接種5×lO7ELD50的F48E8株NDV，攻毒后連續(xù)觀察14天，統(tǒng)計發(fā)病死亡情況，并于攻毒后第5天和第10天采集試驗雞的氣管和泄殖腔棉拭子，接種10日齡SPF雞胚作病

10、毒分離試驗。結(jié)果表明除LP-FPV組全部死亡外，其余均能抵抗F48E8株NDV的攻擊，排毒方面也無顯著差別。 所有試驗雞分別在免疫后7d、14d、21d采血，分離血清，用HI試驗測定血清中的抗體效價。 3.2商品雞免疫rFPV-12LSHAHN后抵抗SY株AIV攻擊的免疫保護(hù)作用將1日齡商品雞隨機(jī)分為3組，20只/組，隔離飼養(yǎng)。于10日齡分別于頸部皮下接種重組病毒rFPV-12LSHAHN、LP-FPV，2×105PFU

11、/只，同時設(shè)H5 AIV油苗對照組，頸部皮下接種，0.2mL/只。免疫后28d，使用SY株H5 AIV，通過滴鼻點眼途徑，以5x104 ELD50/羽的劑量對各組雞進(jìn)行攻毒。攻毒后連續(xù)觀察14天，統(tǒng)計發(fā)病死亡情況，并于攻毒后第4天和第14天采集試驗雞的氣管和泄殖腔棉拭子，接種lO日齡SPF雞胚作病毒分離試驗。結(jié)果表明由于母源抗體的干擾，重組病毒在商品蛋雞體內(nèi)誘生的HI抗體效價遠(yuǎn)低于他們在SPF雞體內(nèi)誘生的HI效價，但仍能夠提供顯著水平的