共表達(dá)H5N1亞型HPAIV HA、NA基因DNA疫苗構(gòu)建及免疫效力評(píng)估.pdf

1、眾多研究表明，基于禽流感HA基因所研制的基因工程病毒活載體疫苗、亞單位疫苗或核酸疫苗均可對(duì)同一HA亞型病毒的攻擊產(chǎn)生近100％的保護(hù)，而對(duì)異源病毒的攻擊保護(hù)性較差。鑒于禽流感病毒的抗原性是不斷變化的，理想的禽流感疫苗需要考慮到它對(duì)不同亞型病毒的保護(hù)性如何，HA作為AIV的重要的結(jié)構(gòu)蛋白恰好具有彌補(bǔ)HI缺陷的某些優(yōu)點(diǎn)，可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異中和抗體。因此，如果能利用其這一特性研制DNA疫苗將為禽流感的免疫預(yù)防帶來極大的方便。 為了研

2、究HA、NA基因DNA疫苗，我們用PCR從質(zhì)粒pBDNA中擴(kuò)增A/Goose/GuangDong/1/96(H5N1)[GD/1/96(H5N1)]NA基因；以含CMV啟動(dòng)子—增強(qiáng)子的pCI，含雞β-actin啟動(dòng)子表達(dá)載體pCAGGS分別構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒pCINA和pCANA.再用pCANA分別與質(zhì)粒pCIoptiHA、pCAoptiHA構(gòu)建雙順反子表達(dá)質(zhì)粒pCIH5N1、pCAH5N1，其中optiHA基因和NA基因都位于各自的強(qiáng)啟

3、動(dòng)子和增強(qiáng)子下，且都帶有獨(dú)立的Poly(A)終止序列，從而保證了此DNA疫苗中的兩個(gè)基因都能獨(dú)立表達(dá)。此項(xiàng)研究為開展雞禽類免疫實(shí)驗(yàn)和免疫藥劑效能的評(píng)估奠定了基礎(chǔ)。 將構(gòu)建質(zhì)粒pCINA、pCANA、pCIoptiH5N1和pCAoptiH5N1分別轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，間接免疫熒光檢測轉(zhuǎn)染后的48小時(shí)293T細(xì)胞；另外以Westermblot檢驗(yàn)上述四種質(zhì)?？煞謩e表達(dá)相應(yīng)的HA、NA蛋白。結(jié)果表明：本試驗(yàn)成功構(gòu)建了表達(dá)優(yōu)化的HA基因

4、和NA基因的DNA疫苗質(zhì)粒pCANA、pCINA、pCAoptiH5N1和pCIoptiH5N1，體外瞬時(shí)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞后用間接免疫熒光及Westernblot方法均檢測到了相應(yīng)的HA、NA蛋白表達(dá)產(chǎn)物，并具有生物活性。 為進(jìn)一步評(píng)估不同免疫源基因構(gòu)建DNA疫苗單獨(dú)、聯(lián)合使用對(duì)SPF免疫雞形成免疫保護(hù)效果，以10μgpCIoptiHA、pCAoptiHA、pCIoptiHA+pCANA、pCAoptiHA+pCANA、pCIo

5、ptiH5N1、pCAoptiH5N1、pCANA的免疫劑量分別肌肉注射免疫3周齡SPF雞，對(duì)照雞則以PBS肌肉注射免疫。首次免疫3周后以相同劑量和途徑加強(qiáng)免疫，加強(qiáng)免疫后2周分別用100LD50的HPAIVGD/1/96(H5N1)、A/FPV/Rostock/34(H7N1)鼻腔感染攻毒，觀察發(fā)病與死亡情況，分別于攻毒后第3、5、7采集喉頭及泄殖腔拭子進(jìn)行病毒分離、滴定檢測排毒情況，同時(shí)檢測免疫后、攻毒前及攻毒后血清HI抗體的動(dòng)態(tài)變

6、化。 以100LD50的HPAIVGD/1/96(H5N1)攻擊實(shí)驗(yàn)結(jié)果：除對(duì)照組和pCANA外，所有免疫組在加強(qiáng)免疫后攻毒前HI抗體轉(zhuǎn)陽，并且HI抗體水平都大于5log2。10μg劑量免疫，pCIoptiHA、pCAoptiHA可對(duì)免疫雞形成100％完全保護(hù)，不發(fā)病，不死亡，但有較多免疫雞排毒；10μg劑量免疫，pCAoptiHA+pCANA可對(duì)免疫雞形成100％完全保護(hù)，并且不發(fā)病、不致死、不排毒；10μg劑量免疫，pCIo

7、ptiHA+pCANA、pCAoptiH5N1、pCIoptiH5N1也能對(duì)免疫雞形成100％完全保護(hù)，不發(fā)病、不死亡，只有個(gè)別免疫雞出現(xiàn)排毒情況。10μg劑量免疫，pCANA形成部分免疫保護(hù)，但排毒免疫雞數(shù)量多。實(shí)驗(yàn)證明了HI抗體在免疫保護(hù)中的主導(dǎo)作用，NI抗體在HI抗體存在的條件下，才明顯表現(xiàn)出增強(qiáng)免疫保護(hù)效果的作用。 以100LD50的HPAIVA/FPV/Rostock/34(H7N1)攻擊實(shí)驗(yàn)結(jié)果：單基因DNA疫苗pC

8、AoptiHA不能提供任何免疫保護(hù)；10μg劑量的pCIoptiHA+pCANA、pCAoptiHA+pCANA、pCIoptiH5N1、pCAoptiH5N1和pCAoptiNA均形成不完全免疫保護(hù)。其中保護(hù)率最高的是pCIoptiH5N1達(dá)75％，10μgpCANA保護(hù)率最低為12.5％。實(shí)驗(yàn)還表明HI(H5)和NI抗體的同時(shí)存在有助于免疫保護(hù)率的提高和免疫雞排毒陽性率降低，盡管HI抗體在H5亞型(免疫原基因)與H7亞型(攻毒HPA

9、IV)之間不存在任何交叉保護(hù)。攻毒后兩周，部分存活免疫雞中不能檢測到H7亞型HI抗體的存在，說明這些雞只未曾感染H7HPAIV。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明：用所構(gòu)建的DNA疫苗免疫SPF雞后，不僅針對(duì)H5亞型HPAIV免疫保護(hù)效果在原有DNA疫苗pCIoptiHA、pCAoptiHA基礎(chǔ)上有所提高，而且還可以部分保護(hù)其他N1亞型HPAIV的攻擊，是具有市場潛力的優(yōu)良疫苗候選株。動(dòng)物實(shí)驗(yàn)除了證明NI抗體在誘導(dǎo)免疫雞只產(chǎn)生免疫保護(hù)中也同樣具有重