基于PoRV VP7與PEDV S基因二聯(lián)DNA疫苗的構建及免疫效力評價.pdf

1、豬輪狀病毒病是由豬輪狀病毒(Porcine Rotavirus，PoRV)引起的一種腹瀉性疾病，主要引起仔豬腹瀉、嘔吐、脫水等。豬流行性腹瀉是由豬流行性腹瀉病毒(Porcineepidemic diarrhea virus，PEDV)引起的一種高度接觸性腸道傳染病，主要引起豬群嘔吐、水樣腹瀉和嚴重脫水等，尤其對哺乳仔豬有極高致死率。臨床上兩種病毒?；旌细腥?，極大提高仔豬感染后病死率，給養(yǎng)豬業(yè)帶來巨大經(jīng)濟損失。目前，針對上述病毒尚無特效藥

2、治療，為了預防和控制這些疾病，安全、高效的疫苗研究是首要解決途徑。
　　1、PoRV VP7、PEDV S目的基因的克隆及生物信息學分析
　　本實驗根據(jù)Genbank收錄的PoRV OSU代表株(登錄號KJ450849)和PEDV CV777株(AF353511)全基因分別設計1對引物VP7-a/VP7-b和S-a/S-b。經(jīng)RT-PCR從PoRVSC-R毒株、PEDV SC-P毒株RNA樣品中分別擴增出長度986 bp、9

3、89bp的基因片段。經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化等克隆至PMD19-T(Simple)載體，成功構建了PMD-VP7、PMD-S質(zhì)粒，并經(jīng)PCR鑒定、酶切鑒定和測序鑒定證明克隆片段正確。
　　利用MEGA5.0等軟件分別對PoRV SC-R株VP7、PEDV SC-P株S基因與Genbank參考序列進行同源性分析并構建進化樹。結(jié)果表明，VP7基因同32株世界各地輪狀病毒參考株同源性為94.9％-98.7％，S基因同38株世界各地參考株同源性為94

4、.7％-98.8％。利用不同生物學軟件分別對PoRV VP7、PEDV S目的基因編碼氨基酸進行理化性質(zhì)、疏水性、跨膜區(qū)域、信號肽、抗原決定簇預測等分析，結(jié)果表明本實驗擴增的PoRV VP7、PEDV S目的基因均具有良好的免疫原性。
　　2、聯(lián)合表達PoRV VP7、PEDV S基因真核表達載體的構建
　　分別對PMD-VP7重組質(zhì)粒和pPI-2.EGFP真核表達載體進行EcoRⅠ、KpnⅠ雙酶切反應，回收目的片段并經(jīng)連接

5、、轉(zhuǎn)化，成功構建了pPI-2.EGFP.VP7重組質(zhì)粒。分別對PMD-S和pPI-2.EGFP.VP7重組質(zhì)粒進行KpnⅠ、BamHⅠ雙酶切，回收目的片段并經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化，成功構建了pPI-2.EGFP.VP7.S重組質(zhì)粒，并對其進行酶切鑒定、PCR鑒定和測序鑒定。
　　3、pPI-2.EGFP.VP7.S重組質(zhì)粒的體外表達檢測
　　將pPI-2.EGFP.VP7.S重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至BHK-21細胞，24 h后可見有綠色熒光蛋白

6、表達。取轉(zhuǎn)染后48 h細胞抽提總RNA并進行RT-PCR反應，可分別擴增出同VP7、S目的基因及VP7-S融合基因大小相當?shù)钠危砻鱬PI-2.EGFP.VP7.S轉(zhuǎn)染BHK-21細胞后成功轉(zhuǎn)錄。取轉(zhuǎn)染后60 h細胞樣品進行Western blotting檢測，結(jié)果顯示pPI-2.EGFP.VP7.S在BHK-21細胞中成功表達，其表達蛋白分子量約為98 KDa，且具有良好的反應原性。
　　4、pPI-2.EGFP.VP7.S在

7、小鼠體內(nèi)的動態(tài)分布及安全性研究
　　將pPI-2.EGFP.VP7.S重組質(zhì)粒以100μg/只肌肉注射小鼠后，采集不同時期不同組織抽提DNA并進行VP7-S融合基因的PCR檢測。結(jié)果表明，pPI-2.EGFP.VP7.S核酸疫苗經(jīng)肌肉注射免疫小鼠后3h可到達心臟、肝臟、肺臟、脾臟、腎臟、腦和血液等部位，在腦部可存留42 d，在心臟、血液中存留63 d以上，在注射部位肌肉可存留91 d以上。此外，對免疫小鼠不同時期不同組織進行DNA

8、抽提并純化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)純化后樣品均未擴增出VP7-S條帶，表明pPI-2.EGFP.VP7.S不與宿主染色體DNA整合，從而具有較好的安全性。
　　5、pPI-2.EGFP.VP7.S二聯(lián)核酸疫苗的免疫效果研究
　　將重組質(zhì)粒以不同劑量、不同途徑、不同佐劑免疫小鼠，分別于首免前0d及首免后7d，14 d，21d，28 d，42 d采集血清進行PoRV和PEDV抗體IgG檢測;首免后42 d采集血清進行細胞因子IFN-γ、IL-