囊尾蚴病多期復(fù)合基因疫苗的構(gòu)建及免疫效應(yīng)評價(jià).pdf

1、目的：(1)構(gòu)建包含豬帶絳蟲六鉤蚴期和囊尾蚴期特異性疫苗候選分子的囊尾蚴病多期復(fù)合基因疫苗。(2)評價(jià)該復(fù)合基因疫苗的免疫效應(yīng)。
　　方法：(1)分別提取豬帶絳蟲六鉤蚴和囊尾蚴總RNA，應(yīng)用RT-PCR方法分別擴(kuò)增六鉤蚴期特異性抗原 TSOL18和囊尾蚴期特異性抗原 cC1編碼基因，另外設(shè)計(jì)引物應(yīng)用重疊延伸PCR技術(shù)通過一柔性接頭（linker）(Gly4Ser)3串聯(lián)這兩個(gè)基因，使TSOL18基因在前，cC1基因在后，即融合基因

2、TSOL18+linker+cC1（簡寫為TSOL18/L/cC1）。將TSOL18/L/cC1融合基因裝載至pMD18-T載體中，并測序驗(yàn)證。提取pMD18-TSOL18/L/cC1質(zhì)粒DNA，經(jīng)Xho I和Nhe I雙酶切，純化后的酶切產(chǎn)物TSOL18/L/cC1基因通過T4連接酶與經(jīng)Xho I和Nhe I雙酶切并純化的pVAX1真核表達(dá)質(zhì)粒連接，構(gòu)建pVAX1-TSOL18/L/cC1重組質(zhì)粒，同時(shí)構(gòu)建 pVAX1-TSOL18,

3、 pVAX1-cC1。將所構(gòu)建的重組質(zhì)粒通過陽離子聚合物介導(dǎo)轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，設(shè)轉(zhuǎn)染pVAX1空載體組和未轉(zhuǎn)染組轉(zhuǎn)染；轉(zhuǎn)染72 h后分別收集細(xì)胞，提取轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞總RNA，通過RT-PCR、間接免疫熒光、Western-blot鑒定融合基因在真核細(xì)胞中的表達(dá)狀態(tài)；以構(gòu)建的重組質(zhì)粒肌肉注射小鼠，以免疫組化檢測融合基因在小鼠骨骼肌的真核表達(dá)效果。（2）以 pVAX1-TSOL18、pVAX1-cC1、pVAX1-TSOL18/L/cC1經(jīng)肌

4、肉注射途徑免疫BALB/c小鼠，以流式細(xì)胞術(shù)檢測免疫后小鼠脾淋巴細(xì)胞胞內(nèi)細(xì)胞因子等細(xì)胞免疫指標(biāo)，并以間接ELISA法檢測相應(yīng)的特異性抗體及特異性抗體動(dòng)態(tài)變化等體液免疫指標(biāo)。
　　結(jié)果：(1)構(gòu)建的pVAX1-TSOL18/L/cC1重組質(zhì)粒經(jīng)酶切電泳和測序結(jié)果與預(yù)期設(shè)計(jì)的基因序列一致。真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染后通過RT-PCR檢測顯示除轉(zhuǎn)染pVAX1空載體組和未轉(zhuǎn)染組外，其余各組均有相應(yīng) mRNA的表達(dá)。真核細(xì)胞轉(zhuǎn)染后通過間接免疫熒光、Wes

5、tern-blot檢測表明能夠在293T細(xì)胞中表達(dá)出目的蛋白。免疫組化染色后在重組質(zhì)粒注射部位肌肉組織的肌纖維內(nèi)顯示棕黃色陽性分泌顆粒，并且pVAX1-TSOL18/L/cC1組比pVAX1-TSOL18組棕黃色陽性分泌顆粒多，空載體組與空白對照組骨骼肌組織未見明顯的棕黃色顆粒。（2） pVAX1-TSOL18/L/cC1組小鼠血清 IgG抗體均顯著高于 pVAX1-TSOL18、pVAX1-cC1組及 PBS組和 pVAX1組（P<0

6、.05)。 pVAX1-TSOL18/L/cC1組、pVAX1-TSOL18、pVAX1-cC1組分泌IFN-γ的CD4+T及CD8+T細(xì)胞各亞群比例均顯著高于PBS組和pVAX1組（P<0.05)， pVAX1-TSOL18/L/cC1組又顯著高于 pVAX1-TSOL18、pVAX1-cC1組（P<0.05)；pVAX1-TSOL18/L/cC1組、pVAX1-TSOL18、pVAX1-cC1組分泌IL-4的CD4+T細(xì)胞亞群比例顯

7、著高于PBS組和 pVAX1組（P<0.05)，而 pVAX1-TSOL18/L/cC1組、pVAX1-TSOL18、pVAX1-cC1組與PBS組和pVAX1組組間無顯著差異（P＞0.05）；pVAX1-TSOL18、pVAX1-cC1組分泌IL-4的CD8+T細(xì)胞亞群比例顯著高于PBS組和pVAX1組（P<0.05)，而pVAX1-TSOL18/L/cC1組與與PBS組和pVAX1組組間無顯著差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：