雞痘免疫增強(qiáng)型核酸疫苗構(gòu)建及免疫評(píng)價(jià).pdf

1、本實(shí)驗(yàn)將疑似“混合型”雞痘的病料進(jìn)行病理學(xué)檢查,發(fā)現(xiàn)皮膚、氣管和喉頭病料的細(xì)胞胞漿內(nèi)嗜酸性染色的A型包涵體。病原分離鑒定表明,病毒能在10日齡雞胚絨毛尿囊膜上形成典型的痘斑,并在CEF上形成雞痘病毒典型病變。據(jù)GenBank發(fā)表的FPV美國標(biāo)準(zhǔn)強(qiáng)毒株基因序列,利用Oligo6.0和Primer5.0軟件設(shè)計(jì)1對(duì)擴(kuò)增4bcore蛋白基因引物,通過PCR擴(kuò)增測序及動(dòng)物回歸試驗(yàn)證明所分離的病毒是雞痘病毒(FPV),命名為HH2008。

2、　　 本實(shí)驗(yàn)根據(jù)Afonso等人已發(fā)表的FPV核苷酸全序列(AF198100),針對(duì)FPV140上下游設(shè)計(jì)了1對(duì)引物,PCR擴(kuò)增出FPV140完整的開放閱讀框,進(jìn)行亞克隆構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET30a-ENV,表達(dá)蛋白大小約為42ku。制備兔抗ENV多克隆抗體,抗體效價(jià)可達(dá)到218,Westernblot檢測發(fā)現(xiàn)多抗血清特異性好,可通過ELISA鑒定雞痘病毒。
　　 本試驗(yàn)將FPVORF140基因亞克隆至pVAX1真核表達(dá)載體中

3、,構(gòu)建了重組真核表達(dá)質(zhì)粒pVAX-ENV。利用一段編碼(G4S)3多肽的堿基Linker將ChIFN-γ分別與FPVENV基因進(jìn)行連接,成功構(gòu)建pVAX-ENV-IFN融合基因真核表達(dá)質(zhì)粒。通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將pVAX-ENV和pVAX-ENV-IFN轉(zhuǎn)入BItK21細(xì)胞中并檢測到目的蛋白表達(dá)。重組真核表達(dá)質(zhì)粒免疫雛雞進(jìn)行體內(nèi)表達(dá)檢測,ENV基因和ENV-IFN融合基因能夠在體內(nèi)進(jìn)行表達(dá),同時(shí)表達(dá)后的融合蛋白可以被ChIFN-γ多克隆抗體

4、和FPVENV多克隆抗體檢測出來,進(jìn)一步證明了融合基因表達(dá)的蛋白保留了融合前兩段基因各自的生物學(xué)活性,為后續(xù)動(dòng)物試驗(yàn)提供了理論基礎(chǔ)。
　　 動(dòng)物免疫試驗(yàn)分為5個(gè)組,即E組(FPVENV基因真核表達(dá)質(zhì)粒免疫組)、E-I組(pVAX-ENV-IFN真核表達(dá)質(zhì)粒免疫組)、V組(雞痘商品化疫苗免疫組)、P組(pVAX1空質(zhì)粒免疫組)和PBS對(duì)照組(B組)。利用淋巴細(xì)胞轉(zhuǎn)化試驗(yàn)、酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)和流式細(xì)胞術(shù)對(duì)不同處理組雛雞的各項(xiàng)免疫指標(biāo)進(jìn)

5、行了檢測,最后應(yīng)用病毒攻擊試驗(yàn)比較不同質(zhì)粒免疫組間保護(hù)率的差異。結(jié)果表明,免疫組各日齡雛雞免疫指標(biāo)均比pVAX1空載體組和PBS組高,以ENV-IFN融合基因的結(jié)果尤為顯著。其中T、B淋巴細(xì)胞增殖功能、CD4+、CD8+T細(xì)胞數(shù)量和外周血液中抗FPVENV特異性抗體與pVAX1空載體組和PBS組相比較都有明顯的提高,且以融合基因組和疫苗組最為顯著。綜上所述,ChIFN-γ基因在配合FPV抗原基因免疫過程中,機(jī)體免疫應(yīng)答能力增強(qiáng),提高了機(jī)